Najveće postignuće u području fotobiologije bilo je otkriće A. A. Krasnovskog 1948. reverzibilne fotoredukcijske reakcije klorofila u evakuiranoj otopini piridina u prisutnosti donora vodika (askorbinska kiselina) uz stvaranje ružičastog oblika pigmenta s apsorpcijom maksimalno na 525 nm. Danas je općenito prihvaćeno da je primarna fotokemijska reakcija fotosinteze reverzibilna redoks transformacija klorofila. Kvantni prinos reakcije fotoredukcije klorofila je u otopinama etanol-voda-piridin i voda-piridin. Reakcija Krasnovskog odvija se u nekoliko faza:
U prisutnosti kisika i drugih oksidacijskih sredstava dolazi do reverzne reakcije, uslijed koje se vraća izvorna zelena boja otopine:
U radikalskom anionu elektron je delokaliziran duž orbita sustava konjugiranih veza jezgre kromofora. Dva atoma vodika mogu se vezati za klorofil,
očito različiti putevi ovisno o uvjetima okoliša, što dokazuje identifikacija nekoliko oblika koji se razlikuju po apsorpcijskim i fluorescentnim spektrima. Osim askorbinske kiseline, sljedeći spojevi mogu poslužiti kao donori elektrona i protona: fenilhidrazin, cistein, benzilnikotinamid, NADH, citokrom c; akceptori, osim kisika, su razne azo boje i kinoni, riboflavin, NAD, NADP, viologeni i druge tvari.
Reverzibilna fotoredukcijska reakcija karakteristična je ne samo za klorofil a, već i za druge klorofile i srodne spojeve (klorofil bis, bakterioklorofili a i feofitini a i protoklorofili, razni porfirini). Nije uočeno za fikoeritrin i fikocijanin.
Kasnije je otkriveno da je klorofil također sposoban za reverzibilnu fotooksidaciju u prisutnosti akceptora elektrona u alkoholnim otopinama. Ova reakcija se događa, na primjer, u prisutnosti -kinona u viskoznom mediju na temperaturi. Za razliku od destruktivne oksidacije klorofila pod intenzivnim svjetlom, u ovom slučaju dodavanje redukcijskih sredstava prati djelomična regeneracija izvornog pigmenta. Početne faze fotooksidacije opisane su sljedećom shemom:
Iznimno je važno da sposobnost klorofila u pobuđenom stanju da prihvati ili donira elektron osigurava njegov prijenos protiv termodinamičkog potencijala u ternarnom molekularnom sustavu akceptor - klorofil - donor, odnosno energiju kvanta svjetlosti uz pomoć klorofila. kao posrednik troši se i pohranjuje kada se elektron podigne s "niže" razine energije u donoru na "višu" razinu energije u akceptoru. Rad klorofila kao "elektronske pumpe" demonstriran je u brojnim modelnim sustavima. Učinak senzibiliziranog transporta elektrona "prema gore" opaža se bez obzira na to počinje li ovaj proces fotoredukcijom klorofila
(pobuđeni klorofil prihvaća elektron od donora do osnovne razine, koju je prethodno zauzeo "pobuđeni" fotoelektron, a zatim se "pobuđeni" elektron prenosi na akceptor) ili iz njegove fotooksidacije ("pobuđeni" elektron klorofila predaje se akceptoru, tada donorski elektron prelazi na osnovnu razinu klorofila). Ovi odnosi se mogu ilustrirati dijagramom V.B. Evstigneeva (Sl. 14).
Riža. 14. Fototransfer elektrona u ternarnom sustavu klorofil - oksidator - reduktor (Evstigneev V.B., 1966): a, b - osnovne i pobuđene elektronske razine klorofila; elektronske razine oksidatora i reduktora (I - prije osvjetljenja, II - nakon apsorpcije svjetlosti pigmentom, III - nakon prijelaza elektrona); indeksi 1 (2) i 2 (1) označavaju vremenski slijed prijelaza elektrona tijekom kojih se klorofil oksidira odnosno reducira
Što će biti primarno - redukcija ili oksidacija klorofila određeno je prirodom medija i redoks svojstvima akceptora i donora elektrona. Uistinu, ovisno o uvjetima kiselinsko-bazne ravnoteže u ternarnom sustavu, prevladavaju ili elektron-donorska ili elektron-akceptorska svojstva klorofila.
Zahvaljujući svojoj sposobnosti podvrgavanja reverzibilnoj oksidacijsko-redukcijskoj reakciji, klorofil može poslužiti kao energetski fotokatalizator tijekom fotosinteze, promičući primarno skladištenje svjetlosne energije u obliku reduciranih intermedijera.
Iako još nisu dobiveni nepobitni dokazi o reakciji reverzibilne fotoredukcije - fotooksidacije samog klorofila izravno u fotosintetskim organizmima, brze, reverzibilne promjene u apsorpcijskim spektrima pigmenata, na primjer, u apsorpcijskom pojasu od 890 nm, mogu se povezati s ovu reakciju
jedan od oblika bakterioklorofila i u apsorpcijskom pojasu klorofila a, opažen pri ozračivanju laserskim impulsima.
Podaci o elektronskoj paramagnetskoj rezonanciji (EPR) također podupiru stvaranje radikalnih kationa pigmenata klorofila u stanici. EPR fotosignal u Rhodospirillum rubrurn pripisuje se ionu radikala bakterioklorofila na temelju, prvo, korespondencije između kinetike EPR signala i promjena u apsorpciji na sobnim i niskim (77 K, 4 K) temperaturama; drugo, bliskost redoks potencijala slobodnih radikala i bakterioklorofila a.
Iz Parsonova rada proizlazi da je primarna reakcija u bakterijskoj fotosintezi:
gdje je A? primarni akceptor elektrona nepoznate prirode, koji predstavlja oksidaciju bakterioklorofila.
Laserskom tehnologijom dobivene su vrijedne informacije o kinetici redoks transformacija u reakcijskim centrima fotosintetskih objekata. Otkriveno je, na primjer, da brzina prijenosa elektrona u sustavu donor–fotokemijski aktivni klorofil–akceptor leži u mikrosekundnom području. Tako je za purpurne bakterije vrijeme prijenosa elektrona s pigmenta na akceptor 0,5, a za više biljke 2 μs. Pri takvoj brzini prijenos elektrona s klorofila na akceptor događa se čak i pri temperaturi tekućeg dušika od -196 ° C), što ukazuje na njegovu fizička priroda. Reakcija redukcije fotokemijski aktivnog klorofila (pigmenta donora) odvija se manjom brzinom: za bakterije odnosno više biljke. U reakciji redukcije bilo je moguće izolirati dva paralelna puta, od kojih jedan ovisi, a drugi ne ovisi o temperaturi. Pretpostavlja se da do redukcije fotokemijski aktivnog klorofila dolazi pretežno tijekom druge reakcije.
Dakle, pigmenti klorofila u fotosintetici
organizmi kontroliraju tokove elektrona zbog njihove izravne oksidacije - redukcije, a ne zbog fizičke senzibilizacije (migracije energije) redoks intermedijera (I) s prijenosom elektrona na nosač (P) prema shemi
Štoviše, literatura sugerira da je u jednom od dva fotokemijska sustava fotoredukcija primarna, au drugom fotooksidacija klorofila. Na primjer, utvrđeno je da je primarna fotokemijska reakcija u prvom fotosustavu (PS I) crvenih algi oksidacija aktivnog oblika klorofila.
Dakle, sučelje između fotofizike klorofila i skladištenja apsorbirane svjetlosne energije u organskoj tvari osiguravaju njegove redoks transformacije. Kao rezultat toga, "hladni" elektron vode pretvara se u energetski bogat "vrući" elektron NADPH, čija molekula zadržava sunčevu energiju:
Prema suvremenim konceptima, uklanjanje elektrona iz vode i njegov prijenos u NADPH nije jednostupanjski proces, već višestupanjski proces uzastopnih redoks reakcija u lancu (kaskadi elektrona) specijaliziranih tvari - prijenosnika elektrona.
Za prijenos elektrona iz vode u NAD, biljke su razvile mehanizam koji koristi dva kvanta u seriji za neciklički tok elektrona. Dva neovisna fotokemijska čina odvijaju se jedan za drugim, a za svaki od njih u određenom području stanice postoji poseban fotointetski aparat. Naravno, ova dva područja moraju biti primjereno povezana.
Grafovi ovog dvostrukog procesa u njegovim mogućim varijantama nazivaju se -sheme. Vjeruje se da se elektron najprije “diže” u fotosustav II, uzrokovan svjetlosnom energijom, gdje ga prihvaća određeni akceptor. Elektron tada prolazi kroz niz spontanih (tamnih) reakcija. Istodobno se sekvencijalno prenosi duž dugog lanca redoks spojeva sa sve manjim negativnim potencijalima, tj.
na sve slabije redukcijske agense. Na kraju, elektron ispunjava rupu u fotosustavu; ta se rupa pojavila ranije kada je jedan elektron uklonjen iz sustava, a drugi kvant energije se primjenjuje na elektron, sada u sustavu I, i elektron. prihvaća akceptor, koji u tom slučaju postaje puno jači redukcijski agens od akceptorskog sustava II.
Riža. 12.1. Pojednostavljeno -ychema za neciklički tok elektrona. Y-os prikazuje standardne potencijale redoks spojeva. Njihove numeričke vrijednosti date su približno.
(Manje pojednostavljeno i bliže stvarnosti, to možemo reći u bilo kojem ovaj trenutak u svakom od dva fotosustava postoji određeni broj nasumično raspoređenih rupa.) Rezultat je konačni produkt - reducirani feredoksin, koji preko enzima koji sadrži flavin prenosi elektrone na
Prvu su shemu predložili Hill i Bendoll. Drugi su autori također izrazili ili prihvatili ideju da se fotosinteza temelji na procesu u dva koraka; Za detaljnu izradu sheme uloženi su golemi napori brojnih istraživača. Zatim je bilo potrebno identificirati članove transportnog lanca elektrona i rasporediti ih u odgovarajući redoslijed. Među naj učinkovite metode možemo spomenuti proučavanje akcijskih spektara, kinetike reakcije pomoću pulsne spektrometrije i proučavanje defektnih mutacija. Na sl. 12.1 prikazuje pojednostavljeni novi oblik dijagrama (kako ga je modificirao).
Koliko je poznato, shema se odnosi na sve biljke
Iako se različite skupine biljaka uvelike razlikuju u svojim fotoosjetljivim spojevima. Jedan problem je redoslijed spojeva: citokrom - plastodianin - fotosustav; ovdje prikazani redoslijed temelji se na rezultatima Knaffa i Arnona, kao i Zidov et al.
Riža. 12.2. Chlorella spectrum za spektralno čistu svjetlost. Na ordinatnoj osi prikazana je količina oslobođenog kisika po kvantu:
Polazna točka za stvaranje hipoteze o dva kvanta bila je opažanje da je kod biljaka, kada su na njih zajedno djelovali odgovarajući kvanti svjetlosti različitih valnih duljina, uočeno povećanje prinosa fotosinteze. Akcijski spektar monokromatske svjetlosti prikazan je na Sl. 12.2, ali u rasponu dugih valnih duljina dva različita kvanta koji djeluju sinergistički daju veći prinos od izračunatog zbroja dva odvojena prinosa (sl. 12.3). Na primjer, s mješavinom "crvenih" i "daleko crvenih" kvanta, pronađeno je povećanje fotosinteze za 30%. Poboljšanje je posljedica razlika između spektra djelovanja dvaju sustava. Kao što Myers piše: “Najbolju ideju o učinku poboljšanja daje sljedeći misaoni eksperiment: kada je biljka ozračena svjetlom jedne valne duljine, a drugim svjetlom prave valne duljine, stopa fotosinteze veća je od zbroja intenzitete dobivene zasebnim zračenjem. Još jasniji način da se opiše dobitak je povećanje kvantnog prinosa, mjereno na valnoj duljini, kada se doda drugi (nemjereni) snop ispravne valne duljine
Kod biljaka u fotosustavu I fotoosjetljiva tvar aktivnog centra je . U fotosustavu II aktivno središte apsorbira na kraćoj valnoj duljini - oko.
Riža. 12.3. Pojačavajući učinak klorele. Djelovanje dalekog crvenog svjetla određene valne duljine nadopunjuje (blizu) kratkovalno crveno svjetlo. I - s dodatnim svjetlom; II - bez dodatnog svjetla.
Duysens je svjetlo aktivno u fotosustavu I nazvao "svjetlost I", a u fotosustavu "." Fotosustavi I i II mogu se djelomično razdvojiti preparativnim metodama. U tom slučaju koriste se ili mehaničke sile ili deterdženti.
Kod fotosintetskih bakterija nije pronađen učinak pojačanja.
Od svih fotokemijskih procesa poznatih u prirodi najveća vrijednost Ima fotosinteza. Utemeljitelj teorije fotosinteze je K. A. Timirjazev. Fotosinteza je temelj postojanja cjelokupnog života na Zemlji. Fotosinteza zelenih biljaka jedini je primarni izvor akumulacije organske tvari na Zemlji koja služi za prehranu ljudi i životinja. Sva vegetacija zemaljske kugle stvara godišnje oko 120 milijardi tona organske tvari, od čega oko 10 milijardi tona proizvodi čovjek, uzgajajući prehrambeno i krmno bilje na površini od oko 2,5 milijarde hektara.
U zelenom listu biljke, pod utjecajem sunčevog zračenja, događa se cijeli kompleks fotokemijskih procesa, uslijed kojih iz vode, ugljičnog dioksida i mineralnih soli nastaju škrob, vlakna, bjelančevine, masti i druge složene organske tvari. . Proces fotosinteze je vrlo složen. Provodi se uz izravno sudjelovanje najvažnijeg prirodnog fotokatalizatora, klorofila, a prati ga cijeli ciklus kemijskih transformacija koje ne ovise o sunčevom zračenju. U tim transformacijama sudjeluje veliki broj različitih biokatalizatora – enzima. Ukupna jednadžba za fotosintezu obično se izražava kao reakcija koja pretvara ugljikov dioksid i vodu u heksozu:
6CO 2 + 6H 2 O = C 6 H 12 O 6 + 6O 2
Međutim, ova jednadžba, kao i većina sumarnih jednadžbi u biologiji, ne izražava glavne značajke procesa.
Najvažnija zasluga K. A. Timirjazeva je materijalistički znanstvena osnova fotosinteza. Timirjazev je prvi pokazao da se fotosinteza pokorava zakonu održanja i transformacije energije. Time su opovrgnuti idealistički pogledi na proces fotosinteze, koji su ga objašnjavali djelovanjem nematerijalne “životne sile”.
Jednako važno postignuće Timirjazeva je otkriće uloge klorofila kao senzibilizatora fotokemijskih reakcija koje se odvijaju tijekom fotosinteze. Eksperimentalno je utvrdio da se fotosinteza odvija pretežno u crvenim i plavim zrakama vidljivog spektra. Timiryazev je proveo sljedeći eksperiment. Niz staklenih cijevi ispunjenih mješavinom zraka i ugljičnog dioksida, koje su sadržavale jedan identičan zeleni list, bile su izložene sunčevoj svjetlosti raširenoj pomoću trokutaste prizme tako da je u svakom dijelu sunčevog spektra bila po jedna cijev. Svakih nekoliko sati određen je sadržaj ugljičnog dioksida u epruvetama. Pokazalo se da do apsorpcije CO 2 dolazi samo u onim zrakama koje apsorbira klorofil, odnosno u crvenom, narančastom i žutom dijelu spektra.
Tako je Timirjazev pokazao da je klorofil apsorber svjetlosti u zelenim biljkama i da taj pigment, upijajući kvante svjetlosti, ima sposobnost da ih dalje prenosi do molekula tvari koje su polazni materijali za fotosintezu.
U tim reakcijama klorofil prolazi reverzibilnu redoks transformaciju. Struktura klorofila temelji se na porfirinskoj jezgri koja se naziva klor. Sastoji se od četiri CH-premoštena pirolna ostatka, koji su povezani s dvije glavne i dvije koordinacijske veze sa središnjim atomom magnezija. Osim toga, molekula klorofila sadrži ostatak molekule nezasićenog alkohola fitola velike molekularne težine. Trenutno je poznato najmanje pet vrsta klorofila, koji se međusobno razlikuju u strukturi molekule.
Osim klorofila, koji je glavna vrsta fotosintetskih pigmenata, zeleni list (u tzv. kloroplastima, koji su složene specijalizirane biološke strukture) sadrži i druge pigmente - karotenoide i fikobeline, koji se obično nazivaju pomoćnim. Ovi pigmenti, prema suvremenim idejama, sudjeluju u fotosintezi i štite klorofil od fotooksidacije. Osim pigmenata, glavne komponente kloroplasta, u kojima se zapravo odvija cijeli proces fotosinteze, su lipoidne tvari i proteini, koji sadrže veliki broj enzima potrebnih za sljedeće faze fotosinteze, koji nisu povezani s izloženošću na sunčevo zračenje.
Mnoga pitanja fotosinteze, unatoč brzom razvoju znanosti, do danas su slabo proučena. Kao što je ranije spomenuto, proces fotosinteze sastoji se od dvije faze - svijetle i tamne, a obje su usko povezane jedna s drugom.
Budući da je početni proces fotosinteze apsorpcija svjetlosti od strane klorofila, fotosinteza se može približno prikazati kao sljedeći dijagram.
U svjetlosnom stadiju klorofil, nakon što je apsorbirao kvant svjetlosti, prelazi u pobuđeno stanje iu tom obliku nizom međuprocesa izaziva razgradnju molekule vode na vodikov atom H i OH radikal prema shemi
gdje simbol X konvencionalno označava molekulu klorofila; X* je ista molekula u aktivnom stanju.
Zatim se reducira molekula klorofila, vezana za atom vodika. OH radikali, spajajući se u parove, tvore molekulu vodikovog peroksida H 2 O 2, koji se, kao krhki spoj, razgrađuje na vodu i kisik:
4OH = 2H2O2
2H 2 O 2 = 2H 2 O + O 2
Nakon završetka ovih reakcija počinje tamni stadij procesa fotosinteze, čija je bit prijenos vodika iz reducirane molekule klorofila u molekulu klorofila. CO 2 s obrazovanjem organski spojevi vrsta ugljikohidrata. Ovaj proces se odvija pod djelovanjem odgovarajućih enzima prema shemi: 4H + CO 2 = CH 2 O + H 2 O
Kao rezultat, zbog polimerizacije, dobiva se konačni proizvod fotosinteze - heksoza C 6 H 12 O 6.
Činjenicu da kisik koji se oslobađa tijekom fotosinteze pripada vodi, a ne ugljičnom dioksidu, dokazao je A. P. Vinogradov (1946.) koristeći metodu označenih atoma. Tako se pri korištenju vode H 2 18 O sav njezin kisik 18 O nalazi nakon fotosinteze u slobodnom molekularnom kisiku, a pri radu s C 18 O 2 i H 2 16 0 oslobađa se slobodni kisik 16 O, dok kisik 18 O ulazi u sastav organskih spojeva. Utvrđivanje ove činjenice bilo je bitno za teoriju fotosinteze, jer su ranije mnogi znanstvenici vjerovali da molekularni kisik nastaje raspadom svjetlosti ili fotolizom CO 2 .
Gornji dijagram fotosinteze samo je približan i ne odražava sve detalje ovog iznimno složenog fenomena. U posljednjih godina Utvrđeno je da redukcija jedne molekule CO 2 u ugljik zahtijeva ne jedan, već 8-12 kvanta energije. To ukazuje da se tijekom procesa fotosinteze odvija najmanje osam primarnih fotokemijskih reakcija, koje se odvijaju određenim redoslijedom s drugim (nefotokemijskim) reakcijama.
Poznato je da nije svaka molekula klorofila ili drugog pigmenta koji apsorbira svjetlost i zadržava dovoljnu količinu energije za fotokemijsku reakciju središte takve reakcije. Naime, fotokemijsku aktivnost, tj. izravnu povezanost s fotokemijskom reakcijom, provodi samo jedna molekula od 200-250 molekula klorofila. O ovom fenomenu A.G. Pasynsky piše: “...Moglo bi postojati pogrešno mišljenje da je većina klorofila fotokemijski neaktivna i da igra ulogu rezervne tvari u listu, kao što se ponekad pretpostavljalo u literaturi.
U stvarnosti, ova situacija je nužna posljedica kvantne prirode aktivnog svjetla. Apsorpcija svjetlosti od strane određene molekule klorofila ne događa se u kontinuiranom toku; Svjetlosne kvante koji padaju poput kišnih kapi cijelo vrijeme apsorbiraju različite molekule klorofila.
Prema Rabinovichu, čak i pri izravnoj sunčevoj svjetlosti, svaka molekula klorofila apsorbira kvant svjetlosti samo jednom svakih 0,1 s, a pod nepovoljnijim uvjetima - mnogo rjeđe. U međuvremenu, brzina naknadnih enzimskih reakcija je izuzetno visoka. Kad bi pod tim uvjetima svaka molekula klorofila bila neovisno središte fotokemijske reakcije povezano s potrebnim pomoćnim enzimima, tada bi takav uređaj bio jednako nepraktičan kao kad bi svaki dio krova na koji pada posebna kap kiše bio opremljen s neovisni odvod. Jednostavno ne bi bilo dovoljno mjesta na listu za takav uređaj, a da ne spominjemo činjenicu da bi se koristio samo djelić vremena.
Naprotiv, veza velike skupine (200-250) molekula klorofila s jednim centrom fotokemijske reakcije osigurava njezin kontinuirani rad, kao što veza jednog odvoda na dovoljno veliku površinu krova omogućuje dobivanje od pojedinačnih kapi kontinuirani tok voda. Jasno je da je u ovom slučaju cijela masa molekula klorofila aktivno uključena u blagotvorni proces, iako je povezana sa samo jednim centrom za pretvaranje apsorbirane energije zračenja u kemijsku energiju.”
Sve to još jednom potvrđuje iznimnu složenost procesa fotosinteze, čija svaka faza zahtijeva ne samo određene uvjete okoline, već i vrlo složen sustav pomoćnih tvari, kao i strogo definiran unutarnja struktura intracelularni sadržaj. O važnosti strukturnih čimbenika govori činjenica da zeleni list koji je bio izložen mehaničkom opterećenju (npr. ako se kotrlja po staklu debelom staklenom šipkom) gubi sposobnost fotosinteze.
Proučavanje procesa fotosinteze vrlo je važno ne samo s čisto teoretskog gledišta, već i sa stajališta dobivanja visokih i održivih prinosa. Razumijevanje tih procesa i učenje njima upravljati zadaće su kojima je trenutno usmjerena cijela armija domaćih i stranih znanstvenika.
Vrlo je važno što se događa pod utjecajem UV svjetla reakcije dimerizacije dušičnih baza u DNA i RNA. Glavni kromofori (kromofor je dio molekule koji apsorbira svjetlost i određuje boju tvari) molekula DNA su dušične baze nukleotida. Apsorpcija kvanta UV svjetla dušičnim bazama dovodi do stvaranja elektronički pobuđenih singletnih stanja koja su rezultat P → P* prijelazi.
U elektronički pobuđenom stanju, piridinske baze ulaze u reakciju dimerizacije, koja se sastoji od spajanja dviju dušikovih baza s 5,6 dvostrukom ugljikovom vezom kako bi se formirao ciklobutanski prsten između ostataka molekula dušičnih baza. Dakle, pojedini nukleotidi povezani su ne samo preko ostataka fosforne kiseline, već i preko dušičnih baza. Za ovu reakciju, kvantni prinos je γ = 2 ∙10 -2. Ova reakcija uzrokuje takozvane "točkaste" mutacije; 80% svih smrtonosnih mutacija povezanih s izlaganjem UV zračenju su posljedice dimerizacije timina.
Pri niskom intenzitetu zračenja dolazi do korisnih točkastih mutacija. Kao rezultat zračenja roditeljskih oblika UV svjetlom i selekcijom korisnih svojstava nastala je sorta pšenice Erythrospermum-103.
Tamne reakcije koje se javljaju u stromi ne zahtijevaju svjetlo. Redukcija CO 2 nastaje zbog energije (ATP) i redukcijske sile (NADPH 2) koja nastaje tijekom svjetlosnih reakcija. Tamne reakcije kontroliraju enzimi. Redoslijed ovih reakcija odredili su u SAD-u Calvin, Benson i Bassem između 1946. i 1953.; 1961. Calvin je za ovo djelo dobio Nobelovu nagradu.
Calvinovi eksperimenti
Calvinov se rad temeljio na korištenju radioaktivnog izotopa ugljika 14 C (vrijeme poluraspada 5570 godina, vidi Dodatak 1.3), koji je istraživačima postao dostupan tek 1945. Osim toga, Calvin je koristio papirnatu kromatografiju, koja je u to vrijeme bila relativno relativno nova, još ne baš uobičajena metoda. Kulture jednostaničnih zelenih algi Chlorella (Chlorella) uzgajane su u posebnom aparatu (sl. 9.17). Kultura je držana na 14 CO 2 različita vremenska razdoblja, zatim su stanice brzo fiksirane izlijevanjem suspenzije u vrući metanol. Topljivi produkti fotosinteze ekstrahirani su, koncentrirani i odvojeni korištenjem dvodimenzionalna papirna kromatografija(Sl. 9.18 i Dodatak 1.8.2). Cilj je bio pratiti put kojim označeni ugljik ulazi (putem niza međuproizvoda) u finalni proizvodi fotosinteza. Položaj radioaktivnih spojeva na papiru određen je pomoću autoradiografija: za to je na kromatogram stavljen fotografski film osjetljiv na 14 C zračenje, te je eksponiran, odnosno zacrnjen, na onim mjestima gdje su se nalazile radioaktivne tvari (sl. 9.18). Unutar samo jedne minute inkubacije s 14 CO 2 sintetizirani su mnogi šećeri i organske kiseline, uključujući razne aminokiseline. Međutim, Calvin je pomoću vrlo kratke ekspozicije - od 5 sekundi ili manje - uspio identificirati prvi produkt fotosinteze i utvrditi da je to kiselina koja sadrži tri ugljikova atoma, tj. fosfoglicerinska kiselina(FGK). Zatim je shvatio cijeli lanac međuproizvoda kroz koje se fiksni ugljik prenosi; o ovim fazama će biti riječi kasnije. Od tada se te reakcije nazivaju Calvinov ciklus(ili Calvin-Benson-Bassem ciklus).
Riža. 9.18. A. Fiksacija 14 CO 2 u algama pod kratkotrajnim osvjetljenjem. Određivanje produkata fiksacije papirnom kromatografijom i autoradiografijom. B. Autoradiografi produkata fotosinteze dobiveni nakon kratkotrajnog osvjetljavanja algi u prisutnosti 14 CO 2
9.18. Koje su prednosti korištenja dugoživućih radioaktivnih izotopa u biološkim istraživanjima?
9.19. Koje dobrobiti možete imati uzimanjem klorele umjesto više biljke?
9.20. Zašto je posuda Calvinovog aparata ravna, a ne sferična?
Faze puta ugljika
Fiksacija ugljičnog dioksida:
Akceptor CO 2 je šećer s pet ugljika (pentoza) ribuloza bisfosfat(tj. ribuloza s dvije fosfatne skupine; ovaj spoj se prije nazivao ribuloza difosfat). Adicija CO 2 na određenu tvar naziva se karboksilacija, a enzim koji katalizira takvu reakciju je karboksilaza. Dobiveni produkt sa šest ugljika je nestabilan i odmah se raspada u dvije molekule fosfoglicerinska kiselina(FGK), koji je prvi proizvod fotosinteze. Enzim ribuloza bisfosfat karboksilaza nalazi se u stromi kloroplasta u velike količine je zapravo najzastupljeniji protein na svijetu.
Faza oporavka:
FHA sadrži tri atoma ugljika i ima kiselu karboksilnu skupinu (-COOH). TP je trioza fosfat, ili gliceraldehid fosfat (šećer s tri ugljika); ima aldehidnu skupinu (-CHO).
Za uklanjanje kisika iz PGA (tj. za njegovu obnovu) koristi se redukcijska sila NADPH 2 i energija ATP-a. Reakcija se odvija u dvije faze: prvo se troši dio ATP-a koji nastaje tijekom svjetlosnih reakcija, a zatim se koristi sav NADP·H 2, također dobiven na svjetlu. Ukupni rezultat je redukcija karboksilne skupine kiseline (-COOH) u aldehidnu skupinu (-CHO). Produkt reakcije je trioza fosfat, odnosno šećer s tri ugljikova atoma na koji je vezana fosfatna skupina. U ovoj vezi ima više kemijska energija, nego u FHA, i to je prvi ugljikohidrat koji nastaje tijekom fotosinteze.
Regeneracija akceptora za CO 2 - ribuloza bisfosfat. Dio trioza fosfata (TP) mora se potrošiti na regeneraciju ribuloza bisfosfata koji se koristi u prvoj reakciji. Ovaj proces je složen ciklus koji uključuje šećerne fosfate s 3, 4, 5, 6, 7 atoma ugljika. Ovdje se troši ostatak ATP-a. Sve tamne reakcije sažete su na Sl. 9.19. Na ovoj slici je Calvinov ciklus prikazan kao “crna kutija”, u koju CO 2 i H 2 O ulaze s jedne strane, a trioza fosfat izlazi s druge strane. Kao što se može vidjeti iz ovog dijagrama, ATP ostatak se koristi za fosforilaciju ribuloza bisfosfata, ali detalji ovog složenog lanca reakcija nisu prikazani.
Od sl. 9.19 možemo izvesti sljedeću sumarnu jednadžbu:
Ovdje je važno napomenuti da je za stvaranje dviju molekula trioza fosfata potrebno šest molekula CO2. Jednadžba se može pojednostaviti dijeljenjem svih koeficijenata sa 6:
9.21. Ponovno nacrtajte lik. 9.19, koji pokazuje samo broj ugljikovih atoma koji sudjeluju u reakcijama; na primjer, umjesto 6 RiBF napišite "6 × 5C", itd.
Osnovni podaci o procesu fotosinteze sažeti su u tablici. 9.6.
| Lagane reakcije | Mračne reakcije | |
| Lokalizacija u kloroplastima | Tilakoidi | Stroma |
| Reakcije | Fotokemijski, tj. zahtijevaju svjetlo. Svjetlosna energija uzrokuje prijenos elektrona od "donora" elektrona do njihovih "akceptora" bilo necikličkim ili cikličkim putem. Uključena su dva fotosustava - Ι i ΙΙ. Sadrže molekule klorofila, koje pri upijanju svjetlosne energije emitiraju elektrone. Voda služi kao donor elektrona za neciklički put. Prijenos elektrona dovodi do stvaranja ATP-a (fotofosforilacija) i NADPH 2 (vidi također tablicu 9.5). | Ne zahtijevaju svjetlo. CO 2 je fiksiran kada se veže za akceptor s pet ugljika, ribuloza bisfosfat (RiBP); u tom slučaju nastaju dvije molekule trougljikovog spoja fosfoglicerinske kiseline (PGA), prvog produkta fotosinteze. Dolazi do niza reakcija koje se zajednički nazivaju Calvinov ciklus; u ovom slučaju, akceptor za CO 2 -RiBP se regenerira, a FGA se reducira, pretvarajući se u šećer (vidi također sl. 9.19). |
| Kombinirane jednadžbe |
Svjetlosna faza fotosinteze ovisi o ulasku svjetlosnog zračenja (fotona) u stanicu. U prirodi fotosintezu potiče sunčeva svjetlost.
Sadržano u kloroplastima biljne stanice klorofil i drugi pigmenti detektiraju zračenje specifičnih valnih duljina. Energija fotona prenosi elektrone pigmenta na više razina energije. Umjesto povratka na prethodnu energetsku razinu s povratnom emisijom energije, elektrone hvataju akceptori i prenose duž lanca transporta elektrona ugrađenog u tilakoidnu membranu kloroplasta.
Putem elektrona njihova energija se dijelom gubi, a dijelom troši za sintezu ATP-a i smanjenje NADP-a. Tako solarna energija se pretvara u energiju kemijske veze, koji se zatim koristi u tamnoj fazi za sintezu organska tvar . U tom smislu se svjetlosna faza fotosinteze može nazvati pripremnom.
Lanac prijenosa elektrona sastoji se od pigmenata, enzima i koenzima. Neki su lokalizirani u membrani gotovo nepomični, drugi se kreću, djelujući kao prijenosnici elektrona i protona.
Međutim, svjetlosne reakcije fotosinteze ne događaju se samo na tilakoidnoj membrani. Također lansiraju fotone svjetlosti fotoliza vode. Kao rezultat fotolize, voda se raspada na protone vodika (H +), elektrone (e -) i atome kisika (O). Potonji se, spajajući se u parove, oslobađaju iz stanice u obliku molekularnog kisika (O 2).
Razlog potrebe za fotolizom postaje jasan detaljnijim ispitivanjem reakcija svjetlosne faze koje se odvijaju na tilakoidnoj membrani.
Ovdje funkcioniraju dva fotosustava. To su tzv fotosustav I I fotosustav II. Svaki od njih hvata svjetlosnu energiju, a pobuđeni elektroni izlaze iz svakog i prihvaćaju ih njihovi akceptori. U fotosustavima nastaju elektronske rupe, tj. nedostatak elektrona. Klorofili reakcijskih centara fotosustava postaju pozitivno nabijeni. Da bi sustav ponovno radio, te rupe moraju biti eliminirane zbog priljeva elektrona izvana.
Kod biljaka je svjetlosna faza fotosinteze organizirana na način da Fotosustav I ispunjava rupe elektronima transportiranim iz fotosustava II. I prima elektrone koji nastaju tijekom fotolize vode.
Elektroni koji napuštaju prvi fotosustav, prolazeći kroz transportni lanac elektrona, dolaze do NADP-a. Ovaj koenzim se reducira i negativno nabije. Nakon toga privlači protone vodika, pretvarajući se u NADP H 2. Dakle, fotoliza vode je neophodna za dobivanje protona i elektrona.
Na putu elektrona od drugog fotosustava do prvog dolazi do sinteze ATP-a zbog akumuliranog elektrokemijski gradijent- razlike naboja na različitim stranama membrane.
Pogledajmo pobliže pojednostavljeni dijagram svjetlosne faze fotosinteze:
Osim svjetlosne energije, za fotolizu vode potreban je i enzim koji je na dijagramu označen kao “ kompleks za oksidaciju vode" Ugrađen je u fotosustav. Nastali protoni ostaju u lumenu, a elektroni odlaze u fotosustav II (PSII). Tok elektrona prikazan je plavom točkastom strelicom.
Natpisi P680 i P700 u fotosustavima označavaju valne duljine svjetlosti koje preferirano apsorbiraju PS reakcijski centri. Sami fotosustavi imaju složena struktura. Osim emitiranja elektrona reakcijski centar, također uključuju kompleks za prikupljanje svjetlosti.
Iz PSII elektroni se prenose na koenzim plastokinon. Negativno nabijen, veže protone iz strome. Protonski tok je prikazan crvenom točkastom strelicom. Plastokinon prenosi elektrone i protone do enzima kompleks citokroma b 6 f. Potonji oksidira plastokinon.
Citokrom b 6 f pumpa protone u lumen i prenosi elektrone na sljedeći koenzimski nosač - plastocijanin.
U to vrijeme, zbog protona prenesenih iz strome i nastalih kao rezultat fotolize vode, u lumenu se akumulira dovoljno pozitivnog naboja za "rad" enzima. ATP sintaza. Kroz njegove kanale protoni žure prema vanjskoj strani tilakoidne membrane. Ovu energiju koristi ATP sintaza za sinteza ATP-a iz ADP-a i fosforne kiseline.
Plastocijanin prenosi elektrone do PSI, smanjujući ga. Odavde, kao rezultat djelovanja svjetlosti, elektroni se prenose u feredoksin. Pod djelovanjem enzima feredoksin-NADP reduktaza obnavlja NADP. Ovo također koristi protone koji se nalaze u stromi kloroplasta. Ovdje su ušli, između ostalog, preko kanala ATP sintaze.
Reakcije svjetlosne faze koje se razmatraju su neciklički transport elektrona . Međutim, može se dogoditi i ovaj stupanj fotosinteze ciklički put. U ovom slučaju ferodoksin ne smanjuje NADP, već plastokinon. Na ovaj način PSI dobiva svoje elektrone natrag. U slučaju cikličkog transporta elektrona, ne dolazi do sinteze NADP·H2; svjetlosna faza proizvodi samo ATP.
Neciklički (obični) transport elektrona naziva se i shema prijenosa Z-elektrona. Ako tok elektrona prikažete uzimajući u obzir postupno smanjenje njihove energije, dobit ćete dijagram sličan slovu Z zakrenutom za 90°.
