Proučavanje inhibicije aktivnosti enzima jedan je od načina dešifriranja mehanizma njihova djelovanja. Pristup rješavanju potonjeg problema je proučavanje specifičnosti djelovanja enzima. Zauzvrat, to zahtijeva ispravno mjerenje kinetičkih parametara u prisutnosti analoga supstrata koji se proučava. Razmotrimo načine određivanja prirodu odnosa supstrati, njihovi analozi i inhibitori enzimska aktivnost izračunavanjem niza kinetičkih parametara.
Štoviše, ako je konstanta disocijacije kompleksa K s = K m jednaka:
Inhibitori enzimi se mogu podijeliti u dvije glavne skupine: reverzibilan I nepovratan. Nakon uklanjanja inhibitora prvog tipa, aktivnost enzima se obnavlja; u drugom slučaju, inhibitor se ne može ukloniti ili se aktivnost enzima ne uspostavlja ni nakon uklanjanja inhibitora. Ireverzibilna inhibicija je maksimalna kada je cijeli enzim vezan za inhibitor. Reverzibilna inhibicija dostiže stanje ravnoteže, čiji položaj određuje konstanta inhibicije, karakterizirajući afinitet enzima prema inhibitoru. Shema reverzibilne inhibicije prikazana je u nastavku:
U kompetitivnoj inhibiciji, supstrat i inhibitor vežu se na isto aktivno mjesto enzima. U prisutnosti inhibitora smanjuje se afinitet enzima prema supstratu. Vrijednost se ne mijenja, budući da pri "zasićenoj" koncentraciji supstrat istiskuje inhibitor iz kompleksa s enzimom.
Na nekonkurentna inhibicija supstrat i inhibitor vežu se na različita mjesta u enzimu. Pri tome se vrijednost K ha ne mijenja, a vrijednost V max opada.
Također su mogući srednji ili alternativni slučajevi, na primjer, kada se inhibitor ne veže na enzim, već na kompleks enzim-supstrat, kao u slučaju nenatjecateljski inhibicija, u kojoj se mijenjaju oba kinetička parametra.
Za određivanje tipa inhibicije obično se koristi Lineweaver-Burk dijagram, dobiven za dati supstrat u odsutnosti i prisutnosti inhibitora.
U slučaju kompetitivne inhibicije, ako se odredi vrijednost Kt u prisutnosti inhibitora, konstanta inhibicije može se izračunati pomoću sljedeće formule:
U slučaju nekompetitivne inhibicije, određivanjem promijenjene vrijednosti V, K se može izračunati pomoću sljedeće formule:
Svi biokemijski procesi u stanici međusobno su povezani i ovisni, no neki od njih prvenstveno obavljaju funkciju izgradnje staničnog materijala, a neki ih opskrbljuju izvorima energije. građevinski radovi" Stoga je uobičajeno podijeliti biokemijske procese u dvije glavne vrste: asimilacija, nazvao anabolizam, uključujući sintezu prekursora niske molekularne težine i konstrukciju molekula biopolimera iz njih, i disimilacija, nazvao katabolizam, koji se sastoji od osiguravanja izvora energije, "energetskog pogona" koji pokreće anabolizam.
Razmotrimo osnovne mehanizme procesa transformacije energije u stanici, tj. mehanizmi kataboličkih procesa.
Pravi se razlika između reverzibilne i ireverzibilne inhibicije. Ako inhibitor uzrokuje trajne promjene u prostornoj tercijarnoj strukturi molekule enzima ili modifikaciju funkcionalnih skupina enzima, tada se ova vrsta inhibicije naziva ireverzibilnom. Češće se, međutim, javlja reverzibilna inhibicija, koja se može kvantificirati pomoću Michaelis-Mentenove jednadžbe. Reverzibilna inhibicija se pak dijeli na kompetitivnu i nekompetitivnu, ovisno o tome je li moguće ili ne prevladati inhibiciju enzimske reakcije povećanjem koncentracije supstrata.
Natjecateljska inhibicija mogu uzrokovati tvari koje imaju strukturu sličnu onoj supstrata, ali malo drugačiju od strukture pravog supstrata. Ova se inhibicija temelji na vezanju inhibitora na (aktivno) mjesto vezanja supstrata. Klasičan primjer Sličan tip inhibicije je inhibicija sukcinat dehidrogenaze (SDH) malonskom kiselinom. Ovaj enzim katalizira oksidaciju dehidrogenacijom jantarne kiseline (sukcinata) u fumarnu kiselinu:
Ako se malonat (inhibitor) doda mediju, tada će kao rezultat njegove strukturne sličnosti s pravim supstratom sukcinatom (prisutnost dviju istih ioniziranih karboksilnih skupina) stupiti u interakciju s aktivnim centrom i formirati enzimski inhibitor kompleksa, međutim, prijenos atoma vodika iz malonata potpuno je eliminiran. Strukture supstrata (sukcinat) i inhibitora (malonat) ipak se donekle razlikuju. Stoga se oni natječu za vezanje na aktivno mjesto, a stupanj inhibicije bit će određen omjerom koncentracija malonata i sukcinata, a ne apsolutnom koncentracijom inhibitora. Stoga se inhibitor može reverzibilno vezati za sferment, tvoreći kompleks enzim-inhibitor. Ova vrsta inhibicije ponekad se naziva inhibicija metaboličkog antagonizma (slika 4.20).
U opći oblik reakcija između inhibitora i enzima može se prikazati sljedećom jednadžbom:
Rezultirajući kompleks, nazvan kompleks enzim-inhibitor EI, za razliku od kompleksa enzim-supstrat ES, ne razgrađuje se u produkte reakcije. Konstanta disocijacije EI kompleksa, ili inhibicijska konstanta K i, može se, prema Michaelis–Mentenovoj teoriji, definirati kao omjer konstanti obrnute i prednje reakcije:
Metoda kompetitivne inhibicije našla je široku primjenu u medicinskoj praksi. Poznato je, na primjer, da se sulfonamidi koriste za liječenje određenih zaraznih bolesti uzrokovanih bakterijama. Pokazalo se da su ti lijekovi strukturno slični para-aminobenzojevoj kiselini, koja bakterijska stanica koristi se za sintezu folne kiseline koja je sastavni dio
Riža. 4.20. Djelovanje kompetitivnog inhibitora (shema prema V.L. Kretovichu). E - enzim; S - podloga; P 1 i P 2 - produkti reakcije; I - inhibitor.
bakterijski enzimi. Zbog te strukturne sličnosti, sulfonamid blokira djelovanje enzima istiskujući para-aminobenzojevu kiselinu iz kompleksa s enzimom koji sintetizira folnu kiselinu, što dovodi do inhibicije rasta bakterija.
Nekompetitivnu inhibiciju uzrokuju tvari koje strukturno nisu slične supstratima i često se ne vežu za aktivno središte, već negdje drugdje u molekuli enzima. Stupanj inhibicije u mnogim je slučajevima određen trajanjem djelovanja inhibitora na enzim. Kod ove vrste inhibicije, zbog formiranja stabilne kovalentna veza enzim često prolazi kroz potpunu inaktivaciju, a tada inhibicija postaje nepovratna. Primjer ireverzibilne inhibicije je učinak jodoacetata, DPP, kao i soli dietil-n-nitrofenil fosfata i cijanovodične kiseline. To se djelovanje sastoji od vezanja i isključivanja funkcionalnih skupina ili metalnih iona i molekule enzima.
Ograničena proteoliza.
Regulacija aktivnosti hormonima.
Hormonska regulacija provodi se na genetskoj razini putem reverzibilne fosforilacije. Na primjer, pod utjecajem adrenalina dolazi do procesa razgradnje glikogena. Tijekom tog procesa nastaje neproteinski spoj – y-AMP. γ-AMP je intracelularni hormon (drugi glasnik) i alosterički je regulator velikog broja proteinskih lipaza. γ-AMP nastaje iz ATP-a djelovanjem adenilat ciklaza.
Regulacija aktivnosti kemijskom modifikacijom.
Kemijska modifikacija- vezanje bilo koje funkcionalne skupine na enzim, s naknadnom promjenom njegove aktivnosti. Kemijska modifikacija je reverzibilna. Na primjer, ključni enzimi energetskog metabolizma - fosforilaza, glikogen sintaza kontrolirani su fosforilacijom i defosforilacijom koju provode specifični enzimi - proteinilaza i fosfotaza. A razina aktivnosti ključnih enzima bit će određena omjerom fosforiliranih i defosforiliranih oblika tih enzima.
Svi gastrointestinalni enzimi i enzimi gušterače sintetiziraju se u neaktivnom obliku kao proenzimi. Regulacija se u ovom slučaju svodi na njihovo pretvaranje u aktivni oblik. Na primjer, aktivacija tripsinogena događa se pod djelovanjem enterokinaze i dovodi do cijepanja viška aminokiselinskih sekvenci. U tom slučaju dolazi do stvaranja aktivnog centra i tercijarne strukture tripsina. Ova pojava se zove ograničena proteoliza . Njegovo biološki značaj je da eliminira samoprobavu organa (autokatalizu), do koje npr. dolazi kada se aktivira tripsin u samoj gušterači. Drugo, omogućuje finiju regulaciju količine enzima.
Ograničena proteoliza je pod kontrolom čimbenika okoliša, pH, au stanici - pod kontrolom Ca.
Brzina enzimske reakcije određena je prisutnošću efektora u mediju: aktivatora i inhibitora. Aktivatori povećavaju brzinu reakcije i ponekad je modificiraju, a inhibitori usporavaju.
Aktivatori: koenzimi, Me ioni, SH-reagensi. Aktivirajući učinak povezan je s optimizacijom strukture proteinske molekule i aktivnog središta enzima. Time se poboljšava interakcija između enzima i supstrata.
Aktivator pankreasne lipaze – žučne kiseline.
Aktivator tripsinogena - enterokinaza.
Aktivator kematripsinogena – tripsin.
Aktivator pepsina i amilaze su ioni Ca.
Ja također mogu djelovati kao aktivatori:
Zn je aktivator karboanhidraze.
Inhibitori Uobičajeno je nazvati tvar koja uzrokuje djelomičnu ili potpunu inhibiciju reakcije.
Svi agensi koji uzrokuju denaturaciju enzima su inhibitori. Međutim, takva je inhibicija nespecifična jer nije povezana s mehanizmom djelovanja enzima. Postoji mnogo više specifičnih inhibitora koji djeluju na jedan enzim ili skupinu srodnih enzima. Takvi inhibitori mogu pružiti vrijedne informacije o prirodi aktivnog mjesta enzima. Mehanizam djelovanja mnogih toksina i otrova na tijelo temelji se na inhibiciji enzima. Tako kod trovanja cijanovodičnom kiselinom dolazi do spazma zbog potpune inhibicije dišnih enzima (citokrom oksidaze).
Vrste inhibicije:
1) Reverzibilan
2) Nepovratan
Ako molekula inhibitora uzrokuje postojane promjene ili modifikaciju aktivnog središta enzima, tada takav vrsta inhibicije nazvao nepovratan .
Reverzibilna inhibicija je češća i dijeli se na natjecateljski I nenatjecateljski, ovisno o tome je li moguće ili ne prevladati inhibiciju enzimske reakcije povećanjem (S). Kompetitivna inhibicija je moguća ako postoji strukturna sličnost između supstrata i inhibitora. Na primjer, inhibicija aktivnosti sukcinat dehidrogenaze malonskom kiselinom:
NOOS - 2N NOOS
SN -------- SN
CH SDH CH
NE NE NE
sukcinat fumarat
Ako se u medij doda malonat umjesto sukcinata, tada će on, zbog svoje strukturne sličnosti sa sukcinatom, reagirati s aktivnim centrom LDH. Međutim, u ovom slučaju ne dolazi do prijenosa 2H iz malonata, budući da su strukture malonata i sukcinata ipak donekle različite i natjecat će se za vezanje na aktivno središte SDH, a stupanj inhibicije bit će određen omjerom koncentracije malonata i sukcinata. Osobitost ove inhibicije je reverzibilnost zbog povećanja (S).
I(+) E + I ------ EI
Često se javlja djelomično nekompetitivna inhibicija, u kojoj se smanjenje Vmax kombinira s povećanjem Km. U rijetkim slučajevima, stupanj inhibicije aktivnosti enzima može se povećati s povećanjem (S). Ovo je tzv nekonkurentna inhibicija . U ovom slučaju, moguće je da se inhibitor spoji s ES kompleksom, stoga nastaje neaktivan ili sporo reagirajući kompleks
ES+I ------ESI
Djelovanje mnogih lijekova temelji se na svim tim metodama inhibicije. Na primjer, sulfonamidi se koriste za liječenje nekih infekcija koji su strukturno slični PABA-i, koju bakterijska stanica koristi kao supstrat za sintezu folne kiseline. Zbog sličnosti, sulfonamid blokira djelovanje enzima istiskujući PABA iz ES kompleksa, što dovodi do smanjenja rasta bakterija. Ovaj natjecateljska inhibicija .
Sve biokemijske reakcije koje se odvijaju u tijelu podložne su specifičnoj kontroli, koja se provodi aktivacijskim ili inhibicijskim učinkom na regulatorne enzime. Potonji su obično na početku lanaca metaboličkih transformacija i započinju višefazni proces ili ga inhibiraju. Neke pojedinačne reakcije također su podložne regulaciji. Kompetitivna inhibicija je jedan od glavnih mehanizama za kontrolu katalitičke aktivnosti enzima.
Mehanizam enzimske katalize temelji se na vezanju aktivnog centra enzima s molekulom supstrata (ES kompleks), što rezultira kemijska reakcija uz nastanak i oslobađanje produkta (E+S = ES = EP = E+P).
Inhibicija enzima je smanjenje brzine ili potpuno zaustavljanje procesa katalize. U užem smislu, ovaj pojam označava smanjenje afiniteta aktivnog centra prema supstratu, što se postiže vezanjem molekula enzima na inhibitorske tvari. Potonji može djelovati različiti putevi, na temelju čega su podijeljeni u nekoliko tipova, koji odgovaraju istoimenim mehanizmima inhibicije.
Glavne vrste inhibicije
Ovisno o prirodi procesa, inhibicija može biti dvije vrste:
- Ireverzibilan - uzrokuje trajne promjene u molekuli enzima, lišavajući ga funkcionalne aktivnosti (potonji se ne može obnoviti). Može biti i specifičan i nespecifičan. Inhibitor se kovalentnom interakcijom čvrsto veže za enzim.
- Reverzibilna je glavna vrsta negativne regulacije enzima. Izvodi se zbog reverzibilnog specifičnog vezanja inhibitora na enzimski protein slabim nekovalentnim vezama, podložnim kinetičkom opisu prema Michaelis-Mentenovoj jednadžbi (iznimka je alosterična regulacija).
Postoje dvije glavne vrste reverzibilne inhibicije enzima: kompetitivna (može se oslabiti povećanjem koncentracije supstrata) i nekompetitivna. U potonjem slučaju smanjuje se najveća moguća brzina katalize.
Glavna razlika između kompetitivne i nekompetitivne inhibicije je gdje se regulatorna tvar veže za enzim. U prvom slučaju inhibitor se veže izravno na aktivno mjesto, au drugom na drugi dio enzima, odnosno na kompleks enzim-supstrat.
Postoji također mješoviti tip inhibicija, kod koje vezanje na inhibitor ne sprječava stvaranje ES, ali usporava katalizu. U ovom slučaju regulatorna tvar je dio dvostrukih ili ternarnih kompleksa (EI i EIS). U nekompetitivnom tipu enzim se veže samo na ES.
Značajke reverzibilne kompetitivne inhibicije enzima
Kompetitivni mehanizam inhibicije temelji se na strukturnoj sličnosti regulatorne tvari sa supstratom. Kao rezultat, formira se kompleks aktivnog centra s inhibitorom, konvencionalno označen kao EI.
Reverzibilna konkurentska inhibicija ima sljedeće karakteristike:
- vezanje na inhibitor događa se u aktivnom mjestu;
- inaktivacija molekule enzima je reverzibilna;
- inhibicijski učinak može se smanjiti povećanjem koncentracije supstrata;
- inhibitor ne utječe na maksimalnu brzinu enzimske katalize;
- EI kompleks se može raspasti, što je karakterizirano odgovarajućom konstantom disocijacije.
Ovakvim načinom regulacije inhibitor i supstrat kao da se međusobno natječu (natječu) za mjesto u aktivnom centru, odakle i potječe naziv procesa.
Kao rezultat toga, kompetitivna inhibicija može se definirati kao reverzibilni proces inhibicije enzimske katalize, temeljen na specifičnom afinitetu aktivnog centra za supstancu inhibitora.
Mehanizam djelovanja
Vezanje inhibitora na aktivno mjesto sprječava stvaranje kompleksa enzim-supstrat potrebnog za katalizu. Kao rezultat, molekula enzima postaje neaktivna. Međutim, katalitički centar može kontaktirati ne samo inhibitor, već i supstrat. Vjerojatnost nastanka pojedinog kompleksa ovisi o omjeru koncentracije. Ako ima znatno više molekula supstrata, enzim će s njima reagirati češće nego s inhibitorom.
Utjecaj na brzinu kemijske reakcije
Stupanj inhibicije katalize tijekom kompetitivne inhibicije određen je količinom enzima koju će EI kompleksi formirati. U tom slučaju moguće je povećati koncentraciju supstrata do te mjere da će uloga inhibitora biti istisnuta, a brzina katalize postići najveću moguću vrijednost koja odgovara vrijednosti V max prema Michaelisu. -Mentenova jednadžba.
Ovaj fenomen se objašnjava jakim razrjeđenjem inhibitora. Kao rezultat toga, vjerojatnost da se enzimske molekule vežu na njega svodi se na nulu, a aktivni centri reagiraju samo sa supstratom.
Kinetičke ovisnosti enzimske reakcije uz sudjelovanje kompetitivnog inhibitora
Kompetitivna inhibicija povećava Michaelisovu konstantu (Km), koja je jednaka koncentraciji supstrata potrebnoj za postizanje ½ maksimalne brzine katalize na početku reakcije. Količina enzima koji hipotetski može doći u kontakt sa supstratom ostaje konstantna, a broj stvarno formiranih ES kompleksa ovisi samo o koncentraciji potonjih (EI kompleksi nisu konstantni i supstrat ih može istisnuti).
Kompetitivna inhibicija enzima može se lako odrediti iz grafova kinetičke ovisnosti iscrtanih za različite koncentracije supstrata. U ovom slučaju, vrijednost K m će se promijeniti, ali će V max ostati konstantan.
Kod nekompetitivne inhibicije je suprotno: inhibitor se veže izvan aktivnog mjesta i prisutnost supstrata ne može ni na koji način utjecati na to. Kao rezultat toga, neke molekule enzima se "isključuju" iz katalize, a najveća moguća brzina se smanjuje. Usprkos tome, molekule aktivnog enzima mogu se slobodno vezati za supstrat i pri niskim i pri visokim koncentracijama potonjeg. Stoga Michaelisova konstanta ostaje konstantna.
Grafovi kompetitivne inhibicije u sustavu dvostrukih inverznih koordinata predstavljaju nekoliko ravnih linija koje sijeku ordinatnu os u točki 1/V max. Svaka ravna linija odgovara određenoj koncentraciji supstrata. Različite točke sjecišta s x-osi (1/[S]) označavaju promjenu Michaelisove konstante.
Učinak kompetitivnog inhibitora na primjeru malonata
Tipičan primjer kompetitivne inhibicije je proces smanjenja aktivnosti sukcinat dehidroginaze, enzima koji katalizira oksidaciju jantarne kiseline (sukcinata) u fumarnu kiselinu. Malonat, koji je strukturno sličan sukcinatu, ovdje djeluje kao inhibitor.
Dodavanje inhibitora u medij uzrokuje stvaranje kompleksa malonata sa sukcinat dehidrogenazom. Takva veza ne oštećuje aktivni centar, ali blokira njegovu dostupnost jantarnoj kiselini. Povećanje koncentracije sukcinata smanjuje inhibicijski učinak.
Upotreba u medicini
Mehanizam kompetitivne inhibicije temelj je djelovanja mnogih lijekova, koji su strukturni analozi supstrata nekih metaboličkih putova, čija je inhibicija neophodan dio liječenja bolesti.
Na primjer, za poboljšanje provođenja živčanih impulsa kod mišićnih distrofija potrebno je povećati razinu acetilkolina. To se postiže inhibicijom aktivnosti acetilkolinesteraze koja ga hidrolizira. Kvarterne amonijeve baze koje su dio lijekova (prorezin, endrofonij, itd.) Djeluju kao inhibitori.
Posebnu skupinu čine antimetaboliti, koji osim inhibicijskog djelovanja pokazuju svojstva pseudosupstrata. U ovom slučaju, stvaranje EI kompleksa dovodi do stvaranja biološki inertnog anomalnog produkta. Antimetaboliti uključuju sulfonamide (koriste se u liječenju bakterijskih infekcija), analoge nukleotida (koriste se za zaustavljanje rasta stanica kancerogenog tumora), itd.
Inhibicija konkurencije: definicija, značajke i primjeri - sve o putovanju do mjesta
Pod određenim uvjetima, inhibitor se može lako odvojiti od enzima.
Kompetitivna reverzibilna inhibicija
U ovom slučaju, tvar, po strukturi slična uobičajenom supstratu enzima, veže se na aktivno središte enzima, ali ne može s njim reagirati. Budući da je ovdje, blokira pristup aktivnom centru bilo kojoj molekuli pravog supstrata. Budući da se u ovom slučaju inhibitor i supstrat natječu za prostor na aktivnom mjestu enzima, ovaj se oblik inhibicije naziva natjecateljska inhibicija. To je reverzibilno, jer kako se koncentracija supstrata povećava, brzina reakcije raste.
6.4. Zašto će se brzina reakcije povećati pod ovim uvjetima?
Riža. Slika 6.15 ilustrira jedan primjer natjecateljske inhibicije.
Fenomen kompetitivne inhibicije koristi se u kemoterapije. Cilj kemoterapije je uništiti uzročnika bolesti pomoću određenih kemikalija bez oštećenja tkiva tijela domaćina. Tijekom Drugog svjetskog rata naširoko su korišteni u borbi protiv zaraznih bolesti. sulfa lijekovi, ili sulfonamidi, - derivati sulfanilne kiseline. Sulfonamidi na svoj način kemijska struktura bliski su para-aminobenzojevoj kiselini (PABA), neophodnom faktoru rasta mnogih patogenih bakterija. PABA je potrebna bakterijama za sintezu folne kiseline, koja služi kao kofaktor za enzim. Učinak sulfonamida povezan je s poremećajem sinteze folne kiseline iz PABA.
Životinjske stanice nisu osjetljive na sulfonamide, iako im je za neke reakcije potrebna folna kiselina. To se objašnjava činjenicom da koriste pretvorenu folnu kiselinu; kod životinja nedostaje metabolički put koji bi osigurao njegovu sintezu.
Nekompetitivna reverzibilna inhibicija
Inhibitori ove vrste nisu strukturno povezani sa supstratom ovog enzima; U tom slučaju u stvaranju kompleksa s inhibitorom ne sudjeluje aktivno središte enzima, već neki drugi dio njegove molekule (sl. 6.16). Stvaranje kompleksa povlači za sobom promjenu globularne strukture enzima, a iako je pravi supstrat još uvijek vezan za enzim, kataliza je ipak nemoguća. Primjer je cijanid. Veže se na ione metala koji djeluju kao prostetička skupina u nekim enzimima (osobito u ionima bakra citokrom oksidaze) i inhibira aktivnost tih enzima. Kako se koncentracija inhibitora povećava, brzina enzimske reakcije se sve više smanjuje. Do trenutka zasićenja inhibitorom ispada da je praktički jednak nuli.
