Ele nu sunt incluse în ARN interferent mic. ARN mici și cancer. Etica spiritualitate oncologie hiv p garyaev* un rezumat enfi

Distrugerea ARNm-ului țintă poate avea loc și sub influența ARN-ului mic de interferență (siARN). Interferența ARN este una dintre noile descoperiri revoluționare în biologia moleculară, iar autorii ei au primit a Premiul Nobel. ARN-urile care interferează sunt foarte diferite ca structură față de alte tipuri de ARN și sunt două molecule de ARN complementare cu o lungime de aproximativ 21-28 de baze de azot, care sunt conectate între ele ca niște fire într-o moleculă de ADN. În acest caz, două nucleotide nepereche rămân întotdeauna la marginile fiecărui lanț siARN. Impactul se realizează după cum urmează. Când o moleculă de siARN se găsește în interiorul unei celule, în prima etapă se leagă într-un complex cu două enzime intracelulare - helicaza și nuclează. Acest complex a fost numit RISC ( R N / A- i induse s ilencing c complex; tăcere - engleză taci, taci; tăcere - tăcere, așa este numit procesul de „oprire” a unei gene în literatura engleză și de specialitate). Apoi, helicaza se desfășoară și separă catenele siARN, iar una dintre catene (antisens în structură) în complex cu nucleaza interacționează în mod specific cu regiunea complementară (corespunzând strict acesteia) a ARNm-ului țintă, ceea ce permite nucleazei să o taie. în două părți. Secțiunile tăiate de ARNm sunt apoi expuse acțiunii altor nucleaze ARN celulare, care le taie în continuare în bucăți mai mici.

SiRNA-urile găsite în plante și în organismele animale inferioare (insecte) sunt o parte importantă a unui tip de „imunitate intracelulară” care le permite să recunoască și să distrugă rapid ARN-ul străin. Dacă un ARN care conține un virus a intrat în celulă, un astfel de sistem de protecție îl va împiedica să se înmulțească. Dacă virusul conține ADN, sistemul siRNA îl va împiedica să producă proteine virale (întrucât ARNm-ul necesar pentru aceasta va fi recunoscut și tăiat), iar utilizarea acestei strategii va încetini răspândirea acestuia în organism. S-a stabilit că sistemul siARN este extrem de discriminator: fiecare siARN va recunoaște și va distruge doar propriul ARNm specific. Înlocuirea doar a unei nucleotide în siRNA duce la o scădere bruscă a efectului de interferență. Niciunul dintre blocanții genici cunoscuți până acum nu are o specificitate atât de excepțională pentru gena țintă.

În prezent, această metodă este utilizată în principal în cercetarea științifică pentru a identifica funcțiile diferitelor proteine celulare. Cu toate acestea, ar putea fi folosit și pentru a crea medicamente.

Descoperirea interferenței ARN a dat noi speranțe în lupta împotriva SIDA și cancerului. Este posibil ca, prin utilizarea terapiei cu siARN în combinație cu terapiile tradiționale antivirale și anticancerigene, să se poată obține un efect de potențare, unde cele două tratamente au ca rezultat un efect terapeutic mai mare decât simpla sumă a fiecăruia administrat singur.

Pentru a utiliza mecanismul de interferență cu siARN în celulele de mamifere în scopuri terapeutice, moleculele de siARN dublu catenar gata făcute trebuie introduse în celule. Cu toate acestea, există o serie de probleme care în prezent nu permit acest lucru în practică, cu atât mai puțin pentru a crea forme de dozare. În primul rând, în sânge sunt afectați de primul eșalon al apărării organismului, enzimele - nucleaze, care elimină catenele duble de ARN potențial periculoase și neobișnuite pentru corpul nostru. În al doilea rând, în ciuda numelui lor, ARN-urile mici sunt încă destul de lungi și, cel mai important, poartă o sarcină electrostatică negativă, ceea ce face imposibilă pătrunderea lor pasivă în celulă. Și în al treilea rând, una dintre cele mai importante întrebări este cum să faci siRNA să funcționeze (sau să pătrundă) doar în anumite celule („bolnave”), fără a le afecta pe cele sănătoase? Și, în sfârșit, este problema mărimii. Dimensiunea optimă a unui astfel de ARNsi sintetic este aceeași 21-28 de nucleotide. Dacă îi creșteți lungimea, celulele vor răspunde producând interferon și reducând sinteza proteinelor. Pe de altă parte, dacă încercați să utilizați ARNsi mai mic de 21 de nucleotide, specificitatea legării sale la ARNm dorit și capacitatea de a forma complexul RISC scad brusc. Trebuie remarcat faptul că depășirea acestor probleme este critică nu numai pentru terapia siRNA, ci și pentru terapia genică în general.

S-au făcut deja unele progrese în rezolvarea acestora. De exemplu, oamenii de știință încearcă modificări chimice face mai multe molecule de siARN lipofil, adică capabil să se dizolve în grăsimile care alcătuiesc membrana celulară, facilitând astfel pătrunderea siARN în celulă. Și pentru a asigura specificitatea muncii numai în anumite țesuturi, inginerii genetici includ în constructele lor secțiuni de reglementare speciale, care sunt activate și declanșează citirea informațiilor conținute într-un astfel de construct (și, prin urmare, siRNA, dacă este inclus acolo), numai în anumite celule țesături.

Așadar, cercetătorii de la Universitatea din California, Școala de Medicină din San Diego au dezvoltat un nou sistem eficient pentru furnizarea de ARN interferent mic (siRNA), care suprimă producția de anumite proteine, în celule. Acest sistem ar trebui să devină baza tehnologiei pentru livrarea de medicamente specifice la diferite tipuri de tumori canceroase. „ARN-urile interferente mici, care efectuează un proces numit interferență ARN, au un potențial incredibil de tratare a cancerului”, explică profesorul Steven Dowdy, care a condus cercetarea: „și deși avem încă mult de lucru, acest moment„Am dezvoltat o tehnologie pentru administrarea de medicamente unei populații de celule – atât tumora primară, cât și metastaze, fără a deteriora celulele sănătoase.”

De mulți ani, Dowdy și colegii săi au studiat potențialul anticancer al ARN-urilor mici de interferență. Cu toate acestea, siRNA-urile convenționale sunt molecule minuscule, încărcate negativ, care, datorită proprietăților lor, sunt extrem de dificil de livrat în celule. Pentru a realiza acest lucru, oamenii de știință au folosit o proteină de semnalizare scurtă PTD (domeniu de transducție a peptidei). Anterior, cu utilizarea sa, au fost create peste 50 de „proteine hibride”, în care PTD a fost combinat cu proteine supresoare de tumori.

Cu toate acestea, simpla conexiune a siRNA cu PTD nu duce la livrarea de ARN în celulă: siRNA-urile sunt încărcate negativ, PTD-urile sunt încărcate pozitiv, rezultând formarea unui conglomerat dens de ARN-proteine care nu este transportat prin membrana celulară. . Deci, cercetătorii au cuplat mai întâi PTD la un domeniu de legare a ARN-ului de proteine care a neutralizat sarcina negativă a siRNA (rezultând o proteină de fuziune numită PTD-DRBD). Un astfel de complex ARN-proteină trece cu ușurință prin membrana celulară și intră în citoplasma celulei, unde inhibă în mod specific proteinele ARN mesager care activează creșterea tumorii.

Pentru a testa capacitatea proteinei de fuziune PTD-DRBD de a furniza siARN în celule, oamenii de știință au folosit o linie celulară derivată din cancerul pulmonar uman. După tratarea celulelor cu PTD-DRBD-siRNA, s-a constatat că celulele tumorale au fost cele mai susceptibile la siARN, în timp ce în celulele normale (celule T, celule endoteliale și celule stem embrionare au fost folosite ca martori), unde nu a existat o producție crescută de oncogen. proteine, nu au fost observate efecte toxice.

Aceasta metoda poate fi supus la diferite modificări folosind diferite siARN pentru a suprima diferite proteine tumorale - nu numai cele produse în exces, ci și cele mutante. De asemenea, este posibilă modificarea terapiei în caz de recidivă a tumorilor, care devin de obicei rezistente la medicamentele chimioterapice din cauza noilor mutații.

Bolile oncologice sunt foarte variabile, iar caracteristicile moleculare ale proteinelor celulelor tumorale sunt individuale pentru fiecare pacient. Autorii lucrării consideră că, în această situație, utilizarea ARN-ului mic de interferență este cea mai rațională abordare a terapiei.

Într-o celulă vie, fluxul de informații dintre nucleu și citoplasmă nu se usucă niciodată, dar înțelegerea tuturor „vârtejurilor” sale și descifrarea informațiilor codificate în ea este cu adevărat o sarcină herculeană. Una dintre cele mai importante descoperiri în biologie ale secolului trecut poate fi considerată descoperirea moleculelor de ARN (ARNm sau ARNm) de informație (sau matrice), care servesc ca intermediari care transportă „mesaje” informaționale de la nucleu (de la cromozomi) la citoplasmă. . Rolul decisiv al ARN-ului în sinteza proteinelor a fost prezis încă din 1939 în lucrarea lui Thorbjörn Kaspersson ( Torbjörn Caspersson), Jean Brachet ( Jean Brachet) și Jack Schultz ( Jack Schultz), iar în 1971 George Marbeis ( George Marbaix) a declanșat sinteza hemoglobinei în ovocitele de broaște prin injectarea primului ARN mesager izolat de iepure care codifică această proteină.

În 1956–1957, în Uniunea Sovietică, A. N. Belozersky și A. S. Spirin au dovedit în mod independent existența ARNm și, de asemenea, au descoperit că cea mai mare parte a ARN-ului dintr-o celulă nu este șablon, ci ARN ribozomal(ARNr). ARN ribozomal - al doilea tip „principal” de ARN celular - formează „scheletul” și centrul funcțional al ribozomilor în toate organismele; ARNr (și nu proteinele) este cel care reglează principalele etape ale sintezei proteinelor. În același timp, a fost descris și studiat al treilea tip „principal” de ARN - ARN-uri de transfer (ARNt), care în combinație cu alte două - ARNm și ARNr - formează un singur complex de sinteză a proteinelor. Potrivit ipotezei destul de populare „lumea ARN”, acest acid nucleic a fost cel care a stat chiar la originile vieții pe Pământ.

Datorită faptului că ARN-ul este mult mai hidrofil în comparație cu ADN-ul (datorită înlocuirii dezoxiribozei cu riboză), este mai labil și se poate mișca relativ liber în celulă și, prin urmare, oferă replici de scurtă durată ale informațiilor genetice (ARNm) până la locul unde începe sinteza proteinelor. Cu toate acestea, merită remarcat „inconvenientul” asociat cu aceasta - ARN-ul este foarte instabil. Este stocat mult mai rău decât ADN-ul (chiar și în interiorul unei celule) și se degradează la cea mai mică modificare a condițiilor (temperatură, pH). În plus față de „propria” instabilitate, o mare contribuție aparține ribonucleazelor (sau RNazelor) - o clasă de enzime de scindare a ARN-ului care sunt foarte stabile și „omnipresente” - chiar și pielea mâinilor experimentatorului conține suficiente din aceste enzime pentru a infirma. întregul experiment. Din această cauză, lucrul cu ARN este mult mai dificil decât cu proteine sau ADN - acesta din urmă poate fi în general stocat timp de sute de mii de ani, practic fără nicio deteriorare.

Îngrijire fantastică în timpul lucrului, tri-distilat, mănuși sterile, sticlă de laborator de unică folosință - toate acestea sunt necesare pentru a preveni degradarea ARN-ului, dar menținerea unor astfel de standarde nu a fost întotdeauna posibilă. De aceea pentru o lungă perioadă de timp pur și simplu nu au acordat atenție scurtelor „fragmente” de ARN care contaminau inevitabil soluțiile. Cu toate acestea, de-a lungul timpului, a devenit clar că, în ciuda tuturor eforturilor de a menține sterilitatea zonei de lucru, „rămășițele” au continuat să fie descoperite în mod natural, iar apoi s-a dovedit că mii de ARN dublu catenar scurt sunt întotdeauna prezente în citoplasmă. , îndeplinesc funcții foarte specifice și sunt absolut necesare pentru dezvoltarea normală a celulelor și organismului.

Principiul interferenței ARN

Farmaciştii au devenit, de asemenea, interesaţi de posibilitatea utilizării siRNA, deoarece capacitatea de a reglementa în mod specific funcţionarea genelor individuale promite perspective fără precedent în tratamentul unei multitudini de boli. Dimensiunea mică și specificitatea ridicată a acțiunii promit o eficacitate ridicată și toxicitate scăzută a medicamentelor pe bază de siRNA; totusi rezolva problema livrare siRNA la celulele bolnave din organism nu a avut încă succes - acest lucru se datorează fragilității și fragilității acestor molecule. Și deși zeci de echipe încearcă acum să găsească o modalitate de a direcționa aceste „gloanțe magice” exact către țintă (în interiorul organelor bolnave), ele nu au obținut încă un succes vizibil. Pe lângă aceasta, există și alte dificultăți. De exemplu, în cazul terapiei antivirale, selectivitatea ridicată a acțiunii ARNsi poate fi un deserviciu - deoarece virușii suferă rapid mutații, tulpina modificată își va pierde foarte repede sensibilitatea la ARNsi selectat la începutul terapiei: se știe că înlocuirea unei singure nucleotide în ARNsi duce la o scădere semnificativă a efectului de interferență.

În acest moment, merită amintit din nou - au fost descoperite siRNA-uri numai la plante, nevertebrate și organisme unicelulare; Deși omologii proteinelor pentru interferența ARN (Dicer, complexul RISC) sunt prezenți și la animalele superioare, siRNA-urile nu au fost detectate prin metode convenționale. Ce surpriză a fost când introdus artificial analogii siARN sintetici au provocat un puternic efect specific dependent de doză în culturile de celule de mamifere! Aceasta a însemnat că în celulele vertebratelor, interferența ARN nu a fost înlocuită cu sisteme imunitare mai complexe, ci a evoluat odată cu organismele, transformându-se în ceva mai „avansat”. În consecință, la mamifere a fost necesar să se caute nu analogi exacti ai siARN-urilor, ci succesorii lor evolutivi.

Jucătorul #2 - microARN

Într-adevăr, pe baza mecanismului evolutiv destul de vechi al interferenței ARN, două sisteme specializate pentru controlul funcționării genelor au apărut în organisme mai dezvoltate, fiecare folosind propriul său grup de ARN mici - microARN(microARN) și piRNA(ARNpi, ARN care interacționează cu Piwi). Ambele sisteme au apărut în bureți și celenterate și au evoluat împreună cu acestea, înlocuind ARNsi și mecanismul de interferență a ARN-ului „nud”. Rolul lor în asigurarea imunității este în scădere, deoarece această funcție a fost preluată de mecanisme mai avansate ale imunității celulare, în special, sistemul interferon. Cu toate acestea, acest sistem este atât de sensibil încât declanșează și ARNsi în sine: apariția unui ARN dublu catenar mic într-o celulă de mamifer declanșează un „semnal de alarmă” (activează secreția de interferon și determină exprimarea genelor dependente de interferon, care blochează în întregime toate procesele de traducere). În acest sens, mecanismul interferenței ARN la animalele superioare este mediat în principal de microARN și piARN - molecule monocatenar cu o structură specifică care nu sunt detectate de sistemul de interferon.

Pe măsură ce genomul a devenit mai complex, microARN-urile și piRNA-urile au devenit din ce în ce mai implicate în reglarea transcripției și traducerii. De-a lungul timpului, s-au transformat într-un sistem suplimentar, precis și subtil de reglare a genomului. Spre deosebire de siARN, microARN și piARN (descoperite în 2001, vezi caseta 3) nu sunt produse din molecule străine de ARN dublu catenar, ci sunt inițial codificate în genomul gazdei.

Întâlnește: microARN

Precursorul microARN este transcris din ambele catene de ADN genomic de către ARN polimeraza II, rezultând apariția unei forme intermediare - pri-microARN - care poartă caracteristicile ARNm obișnuit - m 7 G-cap și coada poliA. Acest precursor formează o buclă cu două „cozi” monocatenare și mai multe nucleotide nepereche în centru (Fig. 3). O astfel de buclă suferă o procesare în două etape (Fig. 4): în primul rând, endonucleaza Drosha taie „cozile” de ARN monocatenar din ac de păr, după care ac de păr excizat (pre-microARN) este exportat în citoplasmă, unde este este recunoscut de Dicer, care mai face două tăieturi (se decupează o secțiune dublu, indicată prin culoare în Fig. 3). În această formă, microARN matur, similar cu siARN, este inclus în complexul RISC.

Figura 3. Structura unei molecule precursoare de microARN dublu catenar. Caracteristici principale: prezența secvențelor conservate care formează un ac de păr; prezența unei copii complementare (microARN*) cu două nucleotide „extra” la capătul 3′; o secvență specifică (2–8 pb) care formează un loc de recunoaștere pentru endonucleaze. MicroARN-ul în sine este evidențiat în roșu - este ceea ce Dicer decupează.

Mecanismul de acțiune al multor microARN-uri este similar cu acțiunea siRNA-urilor: un ARN monocatenar scurt (21–25 nucleotide) ca parte a complexului proteic RISC se leagă cu specificitate ridicată la situsul complementar din regiunea 3′ netradusă a ARNm țintă. Legarea conduce la scindarea ARNm de către proteina Ago. Cu toate acestea, activitatea microARN (comparativ cu siARN) este deja mai diferențiată - dacă complementaritatea nu este absolută, mARN-ul țintă nu poate fi degradat, ci doar blocat reversibil (nu va exista nicio traducere). Același complex RISC poate fi, de asemenea, utilizat introdus artificial siARN. Acest lucru explică de ce siARN-urile făcute prin analogie cu protozoarele sunt active și la mamifere.

Astfel, putem completa ilustrarea mecanismului de acțiune al interferenței ARN în organismele superioare (simetrice bilateral) combinând într-o singură figură diagrama de acțiune a microARN-urilor și a siRNA-urilor introduse biotehnologic (Fig. 5).

Figura 5. Schema generalizată de acțiune a microARN-urilor și siARN-urilor artificiale(siRNA-urile artificiale sunt introduse în celulă folosind plasmide specializate - care vizează vectorul siRNA).

Funcțiile microARN

Funcțiile fiziologice ale microARN-urilor sunt extrem de diverse - de fapt, acţionează ca principalii regulatori non-proteici ai ontogenezei. microARN-urile nu anulează, ci completează schema „clasică” de reglare a genelor (inductori, supresori, compactarea cromatinei etc.). În plus, sinteza microARN-urilor în sine este reglată complex (anumite pool-uri de microARN pot fi activate de interferoni, interleukine, factor de necroză tumorală α (TNF-α) și multe alte citokine). Ca urmare, apare o rețea pe mai multe niveluri de acordare a unei „orchesstre” de mii de gene, uimitoare prin complexitatea și flexibilitatea sa, dar acest lucru nu se termină aici.

microARN-urile sunt mai „universale” decât siRNA-urile: genele „ward” nu trebuie să fie 100% complementare - reglarea se realizează și prin interacțiune parțială. Astăzi, unul dintre cele mai fierbinți subiecte din biologia moleculară este căutarea microARN-urilor care acționează ca regulatori alternativi ai procese fiziologice. De exemplu, microARN implicați în reglarea ciclului celular și apoptoza la plante, Drosophila și nematode au fost deja descrise; la om, microARN-urile reglează sistemul imunitar și dezvoltarea celulelor stem hematopoietice. Utilizarea tehnologiilor bazate pe biocipuri (screening cu micro-array) a arătat că grupuri întregi de ARN mici sunt pornite și oprite în diferite etape ale vieții celulare. Pentru procesele biologice au fost identificate zeci de microARN-uri specifice, al căror nivel de expresie în anumite condiții se modifică de mii de ori, subliniind controlabilitatea excepțională a acestor procese.

Până de curând, se credea că microARN-urile doar suprimă - complet sau parțial - activitatea genelor. Cu toate acestea, recent s-a dovedit că acțiunea microARN-urilor poate diferi radical în funcție de starea celulei! Într-o celulă care se divide activ, microARN se leagă de o secvență complementară în regiunea 3′ a ARNm și inhibă sinteza proteinelor (traducere). Cu toate acestea, într-o stare de odihnă sau de stres (de exemplu, atunci când crește într-un mediu sărac), același eveniment duce la efectul exact opus - sinteza crescută a proteinei țintă!

Evoluția microARN

Numărul de soiuri de microARN din organismele superioare nu a fost încă pe deplin stabilit - conform unor date, depășește 1% din numărul de gene care codifică proteine (la om, de exemplu, se spune că există 700 de microARN, iar acest număr este în continuă creștere). microARN-urile reglează activitatea a aproximativ 30% din toate genele (țintele pentru multe dintre ele nu sunt încă cunoscute) și există atât molecule omniprezente, cât și molecule specifice țesutului - de exemplu, un astfel de grup important de microARN reglează maturarea tulpinii de sânge. celule.

Profilul larg de expresie în diferite țesuturi ale diferitelor organisme și prevalența biologică a microARN-urilor indică o origine veche din punct de vedere evolutiv. MicroARN-urile au fost descoperite pentru prima dată în nematozi, iar multă vreme s-a crezut că aceste molecule apar doar în bureți și celenterate; cu toate acestea, au fost descoperite mai târziu în algele unicelulare. Interesant, pe măsură ce organismele devin mai complexe, crește și numărul și eterogenitatea pool-ului de miARN. Acest lucru indică indirect că complexitatea acestor organisme este asigurată, în special, de funcționarea microARN-urilor. Evoluția posibilă a miARN-urilor este prezentată în Figura 6.

Figura 6. Diversitatea microARN în diferite organisme. Cu cât organizarea organismului este mai mare, cu atât se găsesc mai multe microARN-uri în el (numărul dintre paranteze). Speciile în care au fost găsite sunt evidențiate cu roșu. singur microARN.

O conexiune evolutivă clară poate fi stabilită între siRNA și microARN, pe baza următoarelor fapte:

actiunea ambelor tipuri este interschimbabila si este mediata de proteine omoloage;
siRNA-urile introduse în celulele de mamifere „închid” în mod specific genele dorite (în ciuda unei anumite activări a protecției interferonului);
microARN-urile sunt descoperite în tot mai multe organisme antice.

Aceste și alte date sugerează originea ambelor sisteme dintr-un „strămoș” comun. Este, de asemenea, interesant de observat că imunitatea „ARN” ca precursor independent al anticorpilor proteici confirmă teoria originii primelor forme de viață bazate pe ARN și nu pe proteine (amintim că aceasta este teoria favorită a academicianului A.S. Spirin) .

Cu cât mergi mai departe, cu atât devine mai confuz. Jucătorul #3 - piRNA

Deși existau doar doi „jucători” în arena biologiei moleculare - siARN și microARN - principalul „scop” al interferenței ARN părea complet clar. Într-adevăr: un set de ARN-uri și proteine scurte omologi în diferite organisme desfășoară acțiuni similare; Pe măsură ce organismele devin mai complexe, la fel și funcționalitatea.

Cu toate acestea, în procesul de evoluție, natura a creat un alt sistem evolutiv, cel mai recent și foarte specializat, bazat pe același principiu de succes al interferenței ARN. Este despre piARN (piARN, din ARN de interacțiune Piwi).

Cu cât genomul este mai complex organizat, cu atât organismul este mai dezvoltat și mai adaptat (sau invers? ;-). Cu toate acestea, creșterea complexității genomului are și un dezavantaj: devine un sistem genetic complex instabil. Acest lucru duce la necesitatea unor mecanisme responsabile pentru menținerea integrității genomului - altfel „amestecarea” spontană a ADN-ului îl va dezactiva pur și simplu. Elemente genetice mobile ( MGE) - unul dintre principalii factori ai instabilității genomului - sunt regiuni scurte instabile care pot fi transcrise în mod autonom și migrează în întregul genom. Activarea unor astfel de elemente transpozabile duce la rupturi multiple de ADN în cromozomi, care pot avea consecințe letale.

Numărul de MGE crește neliniar cu dimensiunea genomului, iar activitatea lor trebuie să fie conținută. Pentru a face acest lucru, animalele, începând cu celenterate, folosesc același fenomen de interferență ARN. Această funcție este îndeplinită și de ARN-urile scurte, dar nu de cele despre care au fost deja discutate, ci de un al treilea tip dintre ele - piRNA-urile.

„Portretul” piRNA

Funcțiile piRNA

Funcția principală a piRNA este de a suprima activitatea MGE la nivelul transcripției și translației. Se crede că piRNA-urile sunt active numai în timpul embriogenezei, când amestecarea imprevizibilă a genomului este deosebit de periculoasă și poate duce la moartea embrionului. Acest lucru este logic - atunci când sistemul imunitar nu a început încă să funcționeze, celulele embrionului au nevoie de o protecție simplă, dar eficientă. Embrionul este protejat în mod fiabil de agenții patogeni externi de către placentă (sau coaja de ou). Dar, pe lângă aceasta, este necesară și apărarea împotriva virusurilor endogene (interne), în primul rând MGE.

Acest rol al piRNA a fost confirmat de experiență - „knockout” sau mutațiile genelor Ago3, Piwi sau Aub duc la tulburări grave de dezvoltare (și o creștere bruscă a numărului de mutații în genomul unui astfel de organism) și, de asemenea, provoacă infertilitate din cauza perturbării dezvoltării celulelor germinale.

Distribuția și evoluția piRNA-urilor

Primele piRNA se găsesc deja în anemonele de mare și bureții. Se pare că plantele au luat o cale diferită - proteinele Piwi nu au fost găsite în ele, iar rolul unui „bot” pentru transpozoni este îndeplinit de endonucleaza Ago4 și siARN.

La animalele superioare - inclusiv la oameni - sistemul piARN este foarte bine dezvoltat, dar poate fi găsit doar în celulele embrionare și în endoteliul amniotic. De ce distribuția piRNA în organism este atât de limitată, rămâne de văzut. Se poate presupune că, ca orice armă puternică, piRNA-urile sunt benefice doar în condiții foarte specifice (în timpul dezvoltării fetale), iar în corpul adult activitatea lor va provoca mai mult rău decât bine. Cu toate acestea, numărul de piRNA-uri depășește numărul de proteine cunoscute cu un ordin de mărime, iar efectele nespecifice ale piRNA-urilor în celulele mature sunt dificil de prezis.

Tabelul 1. Proprietățile tuturor celor trei clase de ARN-uri scurte

	siARN	microARN	piRNA
Răspândirea	plante, Drosophila, C. elegans. Nu se găsește la vertebrate	eucariote	Celulele embrionare ale animalelor (începând cu celenterate). Nu în protozoare și plante
Lungime	21–22 nucleotide	19-25 nucleotide	24–30 nucleotide
Structura	Dublu catenar, 19 nucleotide complementare și două nucleotide nepereche la capătul 3′	Structură complexă cu un singur lanț	Structură complexă cu un singur lanț. U la capătul 5′, capătul 2′ O-capătul 3′ metilat
Prelucrare	Dicer-dependent	Dicer-dependent	Dicer-independent
Endonucleazele	Ago2	Ago1, Ago2	Ago3, Piwi, Aub
Activitate	Degradarea mARN-urilor complementare, acetilarea ADN-ului genomic	Degradarea sau inhibarea translației ARNm țintă	Degradarea ARNm care codifică MGE, reglarea transcripției MGE
Rolul biologic	Apărare imună antivirale, suprimarea activității propriilor gene	Reglarea activității genelor	Suprimarea activității MGE în timpul embriogenezei

Concluzie

În concluzie, aș dori să ofer un tabel care ilustrează evoluția aparatului proteic implicat în interferența ARN (Fig. 9). Se poate observa că la protozoare sistemul siRNA (familiile de proteine Ago, Dicer) este cel mai dezvoltat și, pe măsură ce organismele devin mai complexe, accentul se mută către sisteme mai specializate - numărul de izoforme de proteine pentru microARN (Drosha, Pasha) și piRNA. (Piwi, Hen1) crește. În același timp, diversitatea enzimelor care mediază acțiunea siARN scade.

Figura 9. Diversitatea proteinelor implicate în interferența ARN(numerele indică numărul de proteine din fiecare grup). Albastru sunt evidențiate elemente caracteristice siARN și microARN și roșu- proteine Și legate de piRNA.

Fenomenul interferenței ARN a început să fie folosit de cele mai simple organisme. Pe baza acestui mecanism, natura a creat un prototip al sistemului imunitar, iar pe măsură ce organismele devin mai complexe, interferența ARN devine un regulator indispensabil al activității genomului. Două mecanisme diferite plus trei tipuri de ARN scurt ( cm. fila. 1) - ca urmare, vedem mii de regulatori fini ai diferitelor căi metabolice și genetice. Această imagine uimitoare ilustrează versatilitatea și adaptarea evolutivă a sistemelor biologice moleculare. ARN-urile scurte dovedesc din nou că nu există „lucruri mici” în interiorul celulei - există doar molecule mici, a căror semnificație deplină a rolului abia începem să înțelegem.

(Adevărat, o asemenea complexitate fantastică sugerează mai degrabă că evoluția este „oarbă” și acționează fără un „pre-aprobat” Planul principal» »;

Andrew Grimson, Mansi Srivastava, Bryony Fahey, Ben J. Woodcroft, H. Rosaria Chiang, et. al.. (2008). Originile timpurii și evoluția microARN-urilor și a ARN-urilor care interacționează cu Piwi la animale. Natură. 455 , 1193-1197;

A. A. Aravin, G. J. Hannon, J. Brennecke. (2007). Calea Piwi-piRNA oferă o apărare adaptivă în cursa înarmărilor cu transpozon. Ştiinţă. 318 , 761-764;

Metafora care stă la baza denumirii fenomenului de interferență ARN se referă la experimentul cu petunia, când genele sintetazei pigmentului roz și violet introduse artificial în plantă nu au crescut intensitatea culorii, ci, dimpotrivă, au scăzut-o. În mod similar, în interferența „obișnuită”, suprapunerea a două unde poate duce la „anulare” reciprocă.

Într-o celulă vie, fluxul de informații dintre nucleu și citoplasmă nu se usucă niciodată, dar înțelegerea tuturor „vârtejurilor” sale și descifrarea informațiilor codificate în ea este cu adevărat o sarcină herculeană. Una dintre cele mai importante descoperiri în biologie ale secolului trecut poate fi considerată descoperirea moleculelor de ARN (ARNm sau ARNm) de informație (sau matrice), care servesc ca intermediari care transportă „mesaje” informaționale de la nucleu (de la cromozomi) la citoplasmă. . Rolul decisiv al ARN-ului în sinteza proteinelor a fost prezis încă din 1939 în lucrările lui Torbjörn Caspersson, Jean Brachet și Jack Schultz, iar în 1971 George Marbaix a lansat sinteza hemoglobinei în ovocite broaște prin injectarea primului ARN mesager izolat de iepure care codifică această proteină. .

În 1956-57, în Uniunea Sovietică, A. N. Belozersky și A. S. Spirin au dovedit în mod independent existența ARNm și, de asemenea, au descoperit că cea mai mare parte a ARN-ului dintr-o celulă nu este șablon, ci ARN ribozomal (ARNr). ARN-ul ribozomal, al doilea tip „principal” de ARN celular, formează „scheletul” și centrul funcțional al ribozomilor în toate organismele; ARNr (și nu proteinele) este cel care reglează principalele etape ale sintezei proteinelor. În același timp, a fost descris și studiat al treilea tip „principal” de ARN - ARN-uri de transfer (ARNt), care în combinație cu alte două - ARNm și ARNr - formează un singur complex de sinteză a proteinelor. Potrivit ipotezei destul de populare „lumea ARN”, acest acid nucleic a fost cel care a stat chiar la originile vieții pe Pământ.

Îngrijire fantastică în timpul lucrului, tridistilat, mănuși sterile, sticlă de laborator de unică folosință - toate acestea sunt necesare pentru a preveni degradarea ARN-ului, dar menținerea unor astfel de standarde nu a fost întotdeauna posibilă. Prin urmare, pentru o lungă perioadă de timp, pur și simplu nu au acordat atenție „fragmentelor” scurte de ARN, care inevitabil au contaminat soluțiile. Cu toate acestea, de-a lungul timpului, a devenit clar că, în ciuda tuturor eforturilor de a menține sterilitatea zonei de lucru, „rămășițele” au continuat să fie descoperite în mod natural, iar apoi s-a dovedit că mii de ARN dublu catenar scurt sunt întotdeauna prezente în citoplasmă. , îndeplinesc funcții foarte specifice și sunt absolut necesare pentru dezvoltarea normală a celulelor și organismului.

Principiul interferenței ARN

Astăzi, studiul micilor ARN-uri de reglementare este una dintre domeniile cu cea mai rapidă dezvoltare ale biologiei moleculare. S-a descoperit că toate ARN-urile scurte își îndeplinesc funcțiile pe baza unui fenomen numit interferență ARN (esența acestui fenomen este suprimarea expresiei genelor în stadiul de transcripție sau translație cu participarea activă a moleculelor mici de ARN). Mecanismul interferenței ARN este prezentat foarte schematic în Fig. 1:

Orez. 1. Bazele interferenței ARN
Moleculele de ARN dublu catenar (dsRNA) sunt neobișnuite în celulele normale, dar reprezintă o etapă esențială în ciclul de viață al multor virusuri. O proteină specială numită Dicer, după ce a detectat dsARN în celulă, o „taie” în fragmente mici. Catena antisens a unui astfel de fragment, care poate fi numit deja ARN interferent scurt (siRNA, de la siRNA - ARN de interferență mic), este legată de un complex de proteine numit RISC (complex de tăcere indusă de ARN), al cărui element central este o endonuclează din familia Argonaute. Legarea la siRNA activează RISC și declanșează o căutare în celulă pentru molecule de ADN și ARN care sunt complementare cu siRNA „șablon”. Soarta unor astfel de molecule urmează să fie distrusă sau inactivată de complexul RISC.

Pentru a rezuma, „scurturi” de ARN dublu catenar străin (inclusiv introdus intenționat) servesc drept „șablon” pentru căutarea și distrugerea la scară largă a ARNm complementar (și acest lucru este echivalent cu suprimarea expresiei genei corespunzătoare) , nu numai într-o celulă, ci și în cele vecine. Pentru multe organisme - protozoare, moluște, viermi, insecte, plante - acest fenomen este una dintre principalele căi de apărare imunitară împotriva infecțiilor.

În 2006, Andrew Fire și Craig Mello au primit Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină „pentru descoperirea fenomenului de interferență ARN - mecanismul de tăcere a genelor cu participarea ARNdc”. Deși însuși fenomenul interferenței ARN a fost descris cu mult înainte (la începutul anilor 1980), lucrarea lui Fire și Mello a subliniat mecanismul de reglementare al ARN-urilor mici și a conturat o zonă necunoscută până acum a cercetării moleculare. Iată principalele rezultate ale muncii lor:

În timpul interferenței ARN, mARN-ul (și nici un altul) este scindat;
ARN-ul dublu catenar acționează (determină clivajul) mult mai eficient decât ARN-ul monocatenar. Aceste două observații au prezis existența unui sistem specializat care mediază acțiunea ARNdc;
ARNds, complementar unei secțiuni de ARNm matur, provoacă scindarea acestuia din urmă. Aceasta a indicat localizarea citoplasmatică a procesului și prezența unei endonucleaze specifice;
O cantitate mică de dsARN (mai multe molecule per celulă) este suficientă pentru a „dezactiva” complet gena țintă, ceea ce indică existența unui mecanism în cascadă de cataliză și/sau amplificare.

Aceste rezultate au pus bazele unei întregi domenii de biologie moleculară modernă - interferența ARN - și au determinat vectorul de lucru al multor grupuri de cercetare din întreaga lume timp de decenii. Până în prezent, au fost descoperite trei grupuri mari de ARN mici care joacă pe câmpul molecular ca „echipă de interferență ARN”. Să le cunoaștem mai detaliat.

Jucătorul #1 – ARN interferent scurt

Specificitatea interferenței ARN este determinată de ARN interferent scurt (siARN) - molecule mici de ARN dublu catenar cu o structură clar definită (vezi Fig. 2).

siRNA-urile sunt cele mai timpurii în evoluție și sunt cele mai răspândite în plante, organisme unicelulare și nevertebrate. La vertebrate, practic nu se găsesc siRNA-uri în mod normal, deoarece au fost înlocuite cu „modele” ulterioare de ARN-uri scurte (vezi mai jos).

siRNA - „șabloane” pentru căutarea în citoplasmă și distrugerea moleculelor de ARNm - au o lungime de 20–25 de nucleotide și o „trăsătură specială”: 2 nucleotide nepereche la capete 3’ și capete fosforilate 5’. ARNsi anti-sens este capabil (nu de la sine, desigur, ci cu ajutorul complexului RISC) să recunoască ARNm și să provoace în mod specific degradarea acestuia: ARNm-ul țintă este tăiat exact la locul exact complementar cu nucleotidele a 10-a și a 11-a ale lanț siRNA anti-sens.

Orez. 2. Mecanism de „interferență” între ARNm și ARNsi
Moleculele scurte de ARN „interfere” pot fie să intre în celulă din exterior, fie să fie „tăiate” în loc din ARN-ul dublu catenar mai lung. Principala proteină necesară pentru tăierea dsARN este endonucleaza Dicer. „Oprirea” genei prin mecanismul de interferență este efectuată de siRNA împreună cu complexul proteic RISC, care constă din trei proteine - endonucleaza Ago2 și două proteine auxiliare PACT și TRBP. Mai târziu s-a descoperit că complexele Dicer și RISC pot folosi ca „sămânță” nu numai ARNds, ci și ARN monocatenar care formează un ac de păr dublu catenar, precum și ARNsi gata făcut (cel din urmă ocolește „tăierea” etapă și se leagă imediat de RISC).

Funcțiile siRNA-urilor în celulele nevertebrate sunt destul de diverse. Primul și principalul lucru este protecția imunitară. Sistemul imunitar „tradițional” (limfocite + leucocite + macrofage) este prezent doar în organismele multicelulare complexe. În organismele unicelulare, nevertebrate și plante (care fie nu au un astfel de sistem, fie sunt la început), apărarea imună se bazează pe interferența ARN. Imunitatea bazată pe interferența ARN nu necesită organe complexe de „antrenament” pentru precursorii celulelor imune (splină, timus); în același timp, varietatea de secvențe scurte de ARN teoretic posibile (421 de variante) este corelată cu numărul de anticorpi proteici posibili ai animalelor superioare. În plus, siRNA-urile sunt sintetizate pe baza ARN-ului „ostil” care a infectat celula, ceea ce înseamnă că, spre deosebire de anticorpi, sunt imediat „adaptați” pentru un anumit tip de infecție. Și deși protecția bazată pe interferența ARN nu funcționează în afara celulei (cel puțin, nu există încă astfel de date), ea oferă imunitate intracelulară mai mult decât satisfăcător.

În primul rând, siRNA creează imunitate antivirală prin distrugerea ARNm sau ARN genomic al organismelor infecțioase (de exemplu, așa au fost descoperite siRNA-urile în plante). Introducerea ARN-ului viral determină o amplificare puternică a siARN-urilor specifice pe baza moleculei de primer - ARN-ul viral însuși. În plus, siRNA-urile suprimă expresia diferitelor elemente genetice mobile (MGE) și, prin urmare, oferă protecție împotriva „infecțiilor” endogene. Mutațiile în genele complexului RISC duc adesea la o instabilitate crescută a genomului datorită activității MGE ridicate; siRNA poate acționa ca un limitator al expresiei propriilor gene, declanșând ca răspuns la supraexpresia lor. Reglarea funcției genelor poate avea loc nu numai la nivelul translației, ci și în timpul transcripției - prin metilarea genelor la histona H3.

În biologia experimentală modernă, importanța interferenței ARN și a ARN-urilor scurte poate fi cu greu supraestimată. A fost dezvoltată o tehnologie pentru a „dezactiva” (sau distruge) genele individuale in vitro (pe culturi de celule) și in vivo (pe embrioni), care a devenit deja un standard de facto atunci când se studiază orice genă. Uneori, chiar și pentru a stabili rolul genelor individuale într-un anumit proces, ele „dezactivează” în mod sistematic toate genele pe rând.

Farmaciştii au devenit, de asemenea, interesaţi de posibilitatea utilizării siRNA, deoarece capacitatea de a reglementa în mod specific funcţionarea genelor individuale promite perspective fără precedent în tratamentul unei multitudini de boli. Dimensiunea mică și specificitatea ridicată a acțiunii promit o eficacitate ridicată și toxicitate scăzută a medicamentelor pe bază de siRNA; Cu toate acestea, nu a fost încă posibil să se rezolve problema eliberării siARN către celulele bolnave din organism - acest lucru se datorează fragilității și fragilității acestor molecule. Și deși zeci de echipe încearcă acum să găsească o modalitate de a direcționa aceste „gloanțe magice” exact către țintă (în interiorul organelor bolnave), ele nu au obținut încă un succes vizibil. Pe lângă aceasta, există și alte dificultăți. De exemplu, în cazul terapiei antivirale, selectivitatea ridicată a acțiunii ARNsi poate fi un deserviciu - deoarece virușii mută rapid, tulpina modificată își va pierde foarte repede sensibilitatea la ARNsi selectat la începutul terapiei: se știe că înlocuirea unei singure nucleotide în ARNsi duce la o scădere semnificativă a efectului de interferență.

În acest moment, merită amintit încă o dată - siRNA-urile au fost găsite numai în plante, nevertebrate și organisme unicelulare; Deși omologii proteinelor pentru interferența ARN (Dicer, complexul RISC) sunt prezenți și la animalele superioare, siRNA-urile nu au fost detectate prin metode convenționale. Ce surpriză a fost când analogii siARN sintetici introduși artificial au provocat un puternic efect specific dependent de doză în culturile de celule de mamifere! Aceasta a însemnat că în celulele vertebratelor, interferența ARN nu a fost înlocuită cu sisteme imunitare mai complexe, ci a evoluat odată cu organismele, transformându-se în ceva mai „avansat”. În consecință, la mamifere a fost necesar să se caute nu analogi exacti ai siARN-urilor, ci succesorii lor evolutivi.

Jucătorul #2 – microARN

Într-adevăr, pe baza mecanismului evolutiv antic al interferenței ARN, organisme mai dezvoltate au dezvoltat două sisteme specializate pentru controlul funcționării genelor, fiecare folosind propriul său grup de ARN-uri mici - microARN și piRNA (Piwi-interacting ARN). Ambele sisteme au apărut în bureți și celenterate și au evoluat împreună cu acestea, înlocuind ARNsi și mecanismul de interferență a ARN-ului „nud”. Rolul lor în asigurarea imunității este în scădere, deoarece această funcție a fost preluată de mecanisme mai avansate ale imunității celulare, în special, sistemul interferon. Cu toate acestea, acest sistem este atât de sensibil încât declanșează și ARNsi în sine: apariția unui ARN dublu catenar mic într-o celulă de mamifer declanșează un „semnal de alarmă” (activează secreția de interferon și determină exprimarea genelor dependente de interferon, care blochează în întregime toate procesele de traducere). În acest sens, mecanismul interferenței ARN la animalele superioare este mediat în principal de microARN și piARN - molecule monocatenar cu o structură specifică care nu sunt detectate de sistemul de interferon.

Pe măsură ce genomul a devenit mai complex, microARN-urile și piRNA-urile au devenit din ce în ce mai implicate în reglarea transcripției și traducerii. De-a lungul timpului, s-au transformat într-un sistem suplimentar, precis și subtil de reglare a genomului. Spre deosebire de siARN, microARN și piARN (descoperite în 2001, vezi Fig. 3, A-B) nu sunt produse din molecule străine de ARN dublu catenar, ci sunt inițial codificate în genomul organismului gazdă.

Precursorul microARN este transcris din ambele catene de ADN genomic de către ARN polimeraza II, rezultând apariția unei forme intermediare - pri-microARN - purtând caracteristicile ARNm obișnuit - m7G capac și coada poliA. Acest precursor formează o buclă cu două „cozi” monocatenar și mai multe nucleotide nepereche în centru (Fig. 3A). O astfel de buclă suferă o procesare în două etape (Fig. B): în primul rând, endonucleaza Drosha taie „cozile” de ARN monocatenar din ac de păr, după care ac de păr excizat (pre-microARN) este exportat în citoplasmă, unde este este recunoscut de către Dicer, care mai face două tăieturi (o secțiune dublu catenară este decupată, indicată prin culoare în Fig. 3A). În această formă, microARN matur, similar cu siARN, este inclus în complexul RISC.

Mecanismul de acțiune al multor microARN-uri este similar cu acțiunea siRNA-urilor: un ARN monocatenar scurt (21–25 nucleotide) ca parte a complexului proteic RISC se leagă cu specificitate ridicată la situsul complementar din regiunea 3’-netradusă a ARNm țintă. Legarea conduce la scindarea ARNm de către proteina Ago. Cu toate acestea, activitatea microARN (comparativ cu siARN) este deja mai diferențiată - dacă complementaritatea nu este absolută, mARN-ul țintă nu poate fi degradat, ci doar blocat reversibil (nu va exista nicio traducere). Același complex RISC poate folosi și ARNsi introduse artificial. Acest lucru explică de ce siARN-urile făcute prin analogie cu protozoarele sunt active și la mamifere.

Astfel, putem completa ilustrarea mecanismului de acțiune al interferenței ARN în organismele superioare (simetrice bilateral) prin combinarea într-o singură figură a diagramei de acțiune a microARN-urilor și a siRNA-urilor introduse biotehnologic (Fig. 3B).

Orez. 3A: Structura unei molecule precursoare de microARN dublu catenar
Caracteristici principale: prezența secvențelor conservate care formează un ac de păr; prezența unei copii complementare (microARN*) cu două nucleotide „extra” la capătul 3’; o secvență specifică (2–8 pb) care formează un loc de recunoaștere pentru endonucleaze. MicroARN-ul în sine este evidențiat în roșu - este ceea ce Dicer decupează.

Orez. 3B: Mecanismul general de procesare a microARN și implementarea activității acestuia

Orez. 3B: Schema generalizată de acțiune a microARN-urilor și siARN-urilor artificiale
SiRNA-urile artificiale sunt introduse în celulă folosind plasmide specializate (vectorul siRNA care vizează).

Funcțiile microARN

microARN-urile sunt mai „universale” decât siRNA-urile: genele „ward” nu trebuie să fie 100% complementare - reglarea se realizează și prin interacțiune parțială. Astăzi, unul dintre cele mai fierbinți subiecte din biologia moleculară este căutarea microARN-urilor care acționează ca regulatori alternativi ai proceselor fiziologice cunoscute. De exemplu, microARN implicați în reglarea ciclului celular și apoptoza la plante, Drosophila și nematode au fost deja descrise; la om, microARN-urile reglează sistemul imunitar și dezvoltarea celulelor stem hematopoietice. Utilizarea tehnologiilor bazate pe biocipuri (screening cu micro-array) a arătat că grupuri întregi de ARN mici sunt pornite și oprite în diferite etape ale vieții celulare. Pentru procesele biologice au fost identificate zeci de microARN-uri specifice, al căror nivel de expresie în anumite condiții se modifică de mii de ori, subliniind controlabilitatea excepțională a acestor procese.

Până de curând, se credea că microARN-urile suprimă doar – complet sau parțial – activitatea genelor. Cu toate acestea, recent s-a dovedit că acțiunea microARN-urilor poate diferi radical în funcție de starea celulei! Într-o celulă care se divide activ, microARN se leagă de o secvență complementară în regiunea 3’ a ARNm și inhibă sinteza proteinelor (traducerea). Cu toate acestea, într-o stare de odihnă sau de stres (de exemplu, atunci când crește într-un mediu sărac), același eveniment duce la efectul exact opus - sinteza crescută a proteinei țintă!

Evoluția microARN

Numărul de soiuri de microARN din organismele superioare nu a fost încă pe deplin stabilit conform unor date, depășește 1% din numărul de gene care codifică proteine (la om, de exemplu, se spune că există 700 de microARN, iar acest număr este; în continuă creștere). microARN-urile reglează activitatea a aproximativ 30% din toate genele (țintele pentru multe dintre ele nu sunt încă cunoscute) și există atât molecule omniprezente, cât și molecule specifice țesutului - de exemplu, un astfel de grup important de microARN reglează maturarea tulpinii de sânge. celule.

Orez. 4. Diversitatea microARN-urilor în diferite organisme
Cu cât organizarea organismului este mai mare, cu atât se găsesc mai multe microARN-uri în el (numărul dintre paranteze). Speciile în care au fost găsite microARN unice sunt evidențiate cu roșu. Conform .

O conexiune evolutivă clară poate fi stabilită între siRNA și microARN, pe baza următoarelor fapte:

actiunea ambelor tipuri este interschimbabila si este mediata de proteine omoloage;
siRNA-urile introduse în celulele de mamifere „închid” în mod specific genele dorite (în ciuda unei anumite activări a protecției interferonului);
microARN-urile sunt descoperite în tot mai multe organisme antice.

Deși existau doar doi „jucători” în arena biologiei moleculare – siARN și microARN – principalul „scop” al interferenței ARN părea complet clar. Într-adevăr: un set de ARN-uri și proteine scurte omologi în diferite organisme desfășoară acțiuni similare; Pe măsură ce organismele devin mai complexe, la fel și funcționalitatea.

Cu toate acestea, în procesul de evoluție, natura a creat un alt sistem evolutiv, cel mai recent și foarte specializat, bazat pe același principiu de succes al interferenței ARN. Vorbim despre piRNA (piRNA, de la Piwi-interaction ARN).

Cu cât genomul este mai complex organizat, cu atât organismul este mai dezvoltat și mai adaptat (sau invers? ;-). Cu toate acestea, creșterea complexității genomului are și un dezavantaj: un sistem genetic complex devine instabil. Acest lucru duce la necesitatea unor mecanisme responsabile pentru menținerea integrității genomului - altfel „amestecarea” spontană a ADN-ului îl va dezactiva pur și simplu. Elementele genetice mobile (MGE), unul dintre principalii factori ai instabilității genomului, sunt regiuni instabile scurte care pot fi transcrise în mod autonom și migrează în întregul genom. Activarea unor astfel de elemente transpozabile duce la rupturi multiple de ADN în cromozomi, care pot avea consecințe letale.

„Portretul” piRNA

ARNpi-urile sunt molecule scurte lungi de 24-30 de nucleotide, codificate în regiunile centromerice și telomerice ale cromozomului. Secvențele multora dintre ele sunt complementare elementelor genetice mobile cunoscute, dar există multe alte piRNA-uri care coincid cu regiuni ale genelor de lucru sau cu fragmente de genom ale căror funcții sunt necunoscute.

piARN-urile (precum și microARN-urile) sunt codificate în ambele catene de ADN genomic; sunt foarte variabile și diverse (până la 500.000 (!) specii într-un singur organism). Spre deosebire de ARNsi și microARN, ele sunt formate dintr-un singur lanț cu o trăsătură caracteristică - uracil (U) la capătul 5’ și un capăt 3’ metilat. Există și alte diferențe:

Spre deosebire de siRNA-uri și microARN-uri, acestea nu necesită procesare de către Dicer;
genele piARN sunt active numai în celulele germinale (în timpul embriogenezei) și în celulele endoteliale din jur;
Compoziția proteică a sistemului piRNA este diferită - acestea sunt endonucleaze din clasa Piwi (Piwi și Aub) și o varietate separată de Argonaute - Ago3.

Procesarea și activitatea piRNA-urilor sunt încă puțin înțelese, dar este deja clar că mecanismul de acțiune este complet diferit de alți ARN-uri scurte - astăzi a fost propus un model de ping-pong al activității lor (Fig. 5 A, B).

Mecanismul ping-pong al biogenezei piRNA

Orez. 5A: Parte citoplasmatică a procesării piRNA
Biogeneza și activitatea piARN-urilor este mediată de familia de endonucleaze Piwi (Ago3, Aub, Piwi). Activitatea piRNA este asigurată de ambele molecule de piARN monocatenar – sens și antisens – fiecare dintre acestea se asociază cu o endonuclează specifică Piwi. ARNpi recunoaște regiunea complementară a mARN-ului transpozonului (catena albastră) și o decupează. Acest lucru nu numai că inactivează transposonul, dar creează și un nou piARN (legat de Ago3 prin metilarea capătului 3' de către metilaza Hen1). Acest piARN, la rândul său, recunoaște ARNm cu transcrierile din clusterul precursor piRNA (catena roșie) - în acest fel ciclul este închis și piARN-ul dorit este produs din nou.

Orez. 5B: piARN în nucleu
În plus față de endonucleaza Aub, endonucleaza Piwi se poate lega și de piARN antisens. După legare, complexul migrează către nucleu, unde provoacă degradarea transcriptelor complementare și rearanjarea cromatinei, provocând suprimarea activității transpozonelor.

Funcțiile piRNA

Distribuția și evoluția piRNA-urilor

La animalele superioare, inclusiv la oameni, sistemul piRNA este foarte bine dezvoltat, dar poate fi găsit doar în celulele embrionare și în endoteliul amniotic. De ce distribuția piRNA în organism este atât de limitată, rămâne de văzut. Se poate presupune că, ca orice armă puternică, piRNA-urile sunt benefice doar în condiții foarte specifice (în timpul dezvoltării fetale), iar în corpul adult activitatea lor va provoca mai mult rău decât bine. Cu toate acestea, numărul de piRNA-uri depășește numărul de proteine cunoscute cu un ordin de mărime, iar efectele nespecifice ale piRNA-urilor în celulele mature sunt dificil de prezis.

Masă rotativă. Proprietățile tuturor celor trei clase de ARN-uri scurte

	siARN	microARN	piRNA
Răspândirea	plante, Drosophila, C. elegans. Nu se găsește la vertebrate	eucariote	Celulele embrionare ale animalelor (începând cu celenterate). Nu în protozoare și plante
Lungime	21-22 nucleotide	19-25 nucleotide	24-30 nucleotide
Structura	Dublu catenar, 19 nucleotide complementare și două nucleotide nepereche la capătul 3’	Structură complexă cu un singur lanț	Structură complexă cu un singur lanț. U la capătul 5', 2'- O-capătul 3' metilat
Prelucrare	Dicer-dependent	Dicer-dependent	Dicer-independent
Endonucleazele	Ago2	Ago1, Ago2	Ago3, Piwi, Aub
Activitate	Degradarea mARN-urilor complementare, acetilarea ADN-ului genomic	Degradarea sau inhibarea translației ARNm țintă	Degradarea ARNm care codifică MGE, reglarea transcripției MGE
Rolul biologic	Apărare imună antivirale, suprimarea activității propriilor gene	Reglarea activității genelor	Suprimarea activității MGE în timpul embriogenezei

Concluzie

În concluzie, aș dori să ofer un tabel care ilustrează evoluția aparatului proteic implicat în interferența ARN (Fig. 6). Se poate observa că protozoarele au cel mai dezvoltat sistem siRNA (familiile de proteine Ago, Dicer), iar pe măsură ce organismele devin mai complexe, accentul se mută către sisteme mai specializate - numărul de izoforme de proteine pentru microARN (Drosha, Pasha) și piRNA ( Piwi, Hen1) crește. În același timp, diversitatea enzimelor care mediază acțiunea siARN scade.

Orez. 6. Diversitatea proteinelor implicate în interferența ARN Și
Cifrele indică numărul de proteine din fiecare grup. Elementele caracteristice siARN și microARN sunt evidențiate cu albastru, iar proteinele asociate cu piRNA sunt evidențiate cu roșu. Conform .

Fenomenul interferenței ARN a început să fie folosit de cele mai simple organisme. Pe baza acestui mecanism, natura a creat un prototip al sistemului imunitar, iar pe măsură ce organismele devin mai complexe, interferența ARN devine un regulator indispensabil al activității genomului. Două mecanisme diferite plus trei tipuri de ARN-uri scurte (vezi tabelul rezumat) - ca rezultat, vedem mii de regulatori fini ai diferitelor căi metabolice și genetice. Această imagine uimitoare ilustrează versatilitatea și adaptarea evolutivă a sistemelor biologice moleculare. ARN-urile scurte dovedesc din nou că nu există „lucruri mici” în interiorul celulei - există doar molecule mici, a căror semnificație deplină a rolului abia începem să înțelegem.

Adevărat, o astfel de complexitate fantastică sugerează mai degrabă că evoluția este „oarbă” și acționează fără un „plan principal” preaprobat.

Literatură

Gurdon J. B., Lane C. D., Woodland H. R., Marbaix G. (1971). Utilizarea ouălor și ovocitelor de broaște pentru studiul ARN-ului mesager și translația acestuia în celulele vii. Nature 233, 177-182;
Spirin A. S. (2001). Biosinteza proteinelor, lumea ARN și originea vieții. Buletinul Academiei Ruse de Științe 71, 320-328;
Elemente: „Genomurile mitocondriale complete ale animalelor dispărute pot fi acum extrase din păr”;
Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. (1998). Interferență genetică puternică și specifică de către ARN-ul dublu catenar în Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-311;
Biomoleculă: „MicroARN-uri descoperite pentru prima dată într-un organism unicelular”;
Covey S., Al-Kaff N., Lángara A., Turner D. (1997). Plantele combate infecția prin tăcere genetică. Nature 385, 781-782;
Biomolecule: „Molecular double-deal: genele umane lucrează pentru virusul gripal”;
Ren B. (2010). Transcriere: Amplificatorii produc ARN necodificator. Natura 465, 173–174;
Taganov K.D., Boldin M.P., Chang K.J., Baltimore D. (2006). Inducerea dependentă de NF-kB a microARN miR-146, un inhibitor care vizează proteinele de semnalizare ale răspunsurilor imune înnăscute. Proc. Natl. Acad. Sci. STATELE UNITE ALE AMERICII. 103, 12481-12486;
O'Connell R. M., Rao D. S., Chaudhuri A. A., Boldin M. P., Taganov K. D., Nicoll J., Paquette R. L., Baltimore D. (2008). Expresia susținută a microARN-155 în celulele stem hematopoietice provoacă o tulburare mieloproliferativă. J. Exp. Med. 205, 585-594;
Biomoleculă: „microARN – cu cât mai departe în pădure, cu atât mai mult lemn de foc”;
Elemente: „Complicația organismului la animalele antice a fost asociată cu apariția de noi molecule reglatoare”;
Grimson A., Srivastava M., Fahey B., Woodcroft B.J., Chiang H.R., King N., Degnan B.M., Rokhsar D.S., Bartel D.P. (2008). Originile timpurii și evoluția microARN-urilor și a ARN-urilor care interacționează cu Piwi la animale. Natura 455, 1193–1197.
Aravin A., Hannon G., Brennecke J. (2007). Calea Piwi-piRNA oferă o apărare adaptivă în cursa înarmărilor cu transpozon. Science 318, 761–764;
Biomolecula: "

A.M. Deichman, S.V. Zinoviev, A.Yu

EXPRESIA GENĂ ȘI RNAS MICI ÎN ONCOLOGIE

GU RONC im. N.N.Blokhin RAMS, Moscova

REZUMAT

Articolul prezintă rolul ARN-urilor mici care controlează majoritatea funcțiilor vitale ale celulei și ale corpului și posibila lor legătură, în special, cu oncogeneza și alte mecanisme intracelulare (inclusiv ipotetice) de exprimare genomică.

Cuvinte cheie: ARN mici, interferență ARN (ARNi), ARN dublu catenar (ARNds), editare ARN, oncogeneză.

A.M. Deichman, S.V.Zinoviev, A.Yu.Baryshnikov.

EXPRESIA GENĂ ȘI RNAS MICI ÎN ONCOLOGIE

N.N. Centrul Rus de Cercetare a Cancerului Blokhin RAMS, MoscovaAu

ABSTRACT

În lucrarea este prezentat rolul ARN-urilor mici care supraveghează funcțiile vitale majoritare ale celulei și organismului și posibila conexiune a acestora, în special cu oncogeneza și cu alte mecanisme intracelulare (inclusiv ipotetice) de exprimare a genomului.

Cuvinte cheie: ARN mici, ARN de interferență (ARNi), ARN dublu catenar (ARNds), editarea ARN, tumorogeneză.

Introducere

Exprimarea genelor individuale și a genomului întreg de eucariote, inclusiv procesarea, tipuri diferite transcripție, splicing, rearanjare, editare ARN, recombinare, traducere, interferență ARN, reglată de anumite proteine (produse ale genelor reglatoare, structurale, homeotice, factori de transcripție), elemente mobile, ARN și efectori cu greutate moleculară mică. Printre ARN-urile de procesare se numără ARNr, ARNt, ARNm, unele tipuri de ARN reglator și ARN mic.

Se știe acum că ARN-urile mici nu codifică proteine, adesea numără sute pe genom și sunt implicate în reglarea exprimării diferitelor gene eucariote (celule somatice, imune, germinale, stem). Procesele de diferențiere (hematopoieză, angiogeneză, adipogeneză, miogeneză, neurogeneză), morfogeneză (inclusiv stadiile embrionare, dezvoltare/creștere, reglare fiziologică), proliferare, apoptoză, carcinogeneză, mutageneză, imunogeneză, îmbătrânire (prelungirea vieții), tăcere epigenetică sunt sub Control ; au fost observate cazuri de reglare metabolică (de exemplu, glicosfingolipide). O clasă mai largă de ARN-uri necodificatoare de 20-300/500 de nucleotide și RNP-urile lor se găsesc nu numai în nucleu/nucleol/citoplasmă, ci și în organele celulare care conțin ADN (mitocondrii animale; microARN și secvențe mici consens pentru transcriptele cloroplastelor). au fost găsite în ARN-ul plantelor).

Pentru controlul și reglementarea v.n. proceselor, este important: 1. ca ARN-urile naturale/artificiale de dimensiuni mici (ARN-uri mici, ARNt, etc.) și complexele lor cu proteine (RNP-uri) să fie capabile de transport celular și mitocondrial transmembranar; 2. că după descompunerea mitocondriilor, o parte din conținutul acestora, ARN și RNP, poate ajunge în citoplasmă și nucleu. Proprietățile enumerate ale ARN-urilor mici (SRNA), al căror rol semnificativ funcțional este doar în creștere în procesul de studiu, au evident o legătură cu factorul de avertizare pentru cancer și alte boli genetice. În același timp, a devenit mai clar importanță mare modificări epigenomice ale cromatinei în timpul apariției tumorilor. Vom lua în considerare doar un număr foarte limitat de cazuri din multe cazuri similare.

ARN-uri mici

Mecanismul de acțiune al ARN-urilor mici este capacitatea lor de a se lega aproape complementar de regiunile 3"-netraduse (3"-UTR) ale ARNm-urilor țintă (care conțin uneori ADN/ARN care transpun elemente MIR/LINE-2, precum și Alu conservator). se repetă) și provoacă interferență ARN (ARNi=ARNi; în special, în timpul unui răspuns antiviral). Complicația, totuși, este că, pe lângă cele celulare, există și ARN-uri mici codificate de virus (herpes, SV40 etc.; EBV, de exemplu, conține 23 și KSHV - 12 miARN) care interacționează cu transcrierile ambelor. virusul și gazda. Numai peste 5 mii de miARN celular/viral sunt cunoscuți la 58 de specii. ARNi inițiază fie degradarea (cu participarea complexului RISC, ARN-Induced Silence Complex) de-a lungul fragmentelor vulnerabile la nuclează ale elicelor continue de lncARN (ARNm ARN dublu catenar etc.), fie inhibarea parțial reversibilă a lncRNA-urilor discontinuu elicoidal în timpul translației ARNm-țintă. ARN-urile mici mature (~15-28 nucleotide) se formează în citoplasmă din precursorii lor procesați nuclear de lungimi diferite (zeci și sute de nucleotide). În plus, ARN-urile mici sunt implicate în formarea structurii cromatinei silențioase, reglarea transcripției genelor individuale, suprimarea expresiei transpozonilor și menținerea structurii funcționale a regiunilor extinse ale heterocromatinei.

Există mai multe tipuri principale de ARN mici. Cele mai bine studiate sunt microARN-urile (miARN-urile) și micile ARN interferente (siRNA-urile). În plus, printre ARN-urile mici, sunt studiate următoarele: piARN-uri active în celulele germinale; ARN-uri interferente mici asociate cu retrotranspozoni endogeni și elemente repetate (cu heterocromatizare locală/globală - începând din fazele incipiente ale embriogenezei; menținerea nivelului telomerilor), rasiRNA-urile Drosophila; adesea codificat de introni ai genelor proteice și important din punct de vedere funcțional în translație, transcripție, splicing (de-/metilare, pseudouridilarea acizilor nucleici) ARN-uri nucleare mici (snRNA) și nucleolare (snoARN); ARN-uri modulatoare mici, ARNsm, cu funcții puțin cunoscute, complementare motivelor NRSE (Neuron Restrictive Silencer Element) de legare la ADN; ARN-uri interferențe mici, tasiARN-uri care transactiva plantele; ARN-uri scurte în ac de păr, shRNA-uri, care furnizează ARNi pe termen lung (tacere stabilă a genei) a structurilor lungi de lncARN în timpul răspunsului antiviral la animale.

ARN-urile mici (miARN, siARN etc.) interacționează cu transcrierile nou sintetizate ale nucleului/citoplasmei (reglarea splicing-ului, translația ARNm; metilarea/pseudouridilarea ARNr etc.) și cromatina (în timpul heterocromatinizării locale și epigenetice moștenite temporare a diviziunii somatice). celule de germeni). Heterocromatinizarea, în special, este însoțită de de-/metilarea ADN-ului, precum și de metilare, acetilare, fosforilare și ubiquitinare a histonelor (modificarea „codului histonelor”).

Primul dintre ARN-urile mici au fost miARN-urile nematodului Caenorhabditis elegans (lin-4), proprietățile și genele lor și ceva mai târziu miARN-urile plantei Arabidopsis thaliana. În prezent, ele sunt asociate cu organisme multicelulare, deși sunt prezentate în alga unicelulară Chlamydomonas reinhardtii și în căile de tăcere asemănătoare ARNi, în legătură cu protecția antivirală / asemănătoare care implică așa-numita. psiARN, discutate pentru procariote. Genomul multor eucariote (inclusiv Drosophila și oamenii) conțin câteva sute de gene miARN. Aceste gene specifice stadiului/țesutului (precum și regiunile ARNm țintă corespunzătoare) sunt adesea foarte omoloage la speciile îndepărtate filogenetic, dar unele dintre ele sunt specifice liniei. miARN-urile sunt conținute în exoni (codificarea proteinelor, gene ARN), introni (cel mai adesea pre-ARNm), distanțieri intergenici (inclusiv repetiții), au o lungime de până la 70-120 de nucleotide (sau mai mult) și formează bucla/tulpina ac de păr structurilor. Pentru determinarea genelor lor, se folosesc nu numai abordări biochimice și genetice, ci și abordări computerizate.

Cea mai tipică lungime a „regiunii de lucru” a miARN-urilor maturi este de 21-22 de nucleotide. Acestea sunt probabil cele mai numeroase dintre genele care nu codifică proteine. Ele pot fi localizate sub formă de copii individuale (mai des) sau clustere care conțin multe gene miARN similare sau diferite, transcrise (adesea din promotori autonomi) ca un precursor mai lung, procesat în mai multe etape în miARN-uri individuale. Se crede că există o rețea de reglare a miARN care controlează multe procese biologice fundamentale (inclusiv tumorigeneza/metastaza); probabil cel puțin 30% din genele exprimate umane sunt reglate de miARN.

Acest proces implică enzimele asemănătoare RNaza III specifice lncRNA Drosha (ribonuclează nucleară; inițiază procesarea pre-miARN-urilor intrronice după despicarea transcriptului principal) și Dicer, care funcționează în citoplasmă și, respectiv, scindează/degradează ac de păr pre- miARN (pentru a maturiza miARN) și structuri hibride miARN/mARN s-au format mai târziu. ARN-uri mici, împreună cu mai multe proteine (inclusiv vn RNazele, proteinele din familia AGO, transmetilaze/acetilaze etc.) și cu participarea așa-numitelor. Complexele asemănătoare RISC și RITS (al doilea induce tăcere transcripțională) sunt capabile, respectiv, să provoace ARNi/degradare și, respectiv, tăcere genică ulterioară la nivelurile ARN (înainte/în timpul traducerii) și ADN (în timpul transcripției heterocromatinei).

Fiecare miARN se asociază potențial cu mai multe ținte și fiecare țintă este controlată de un număr de miARN (reminiscență de editarea pre-ARNm mediată de gARN în cinetoplastele tripanozomilor). Analiza in vitro a arătat că reglarea miARN (precum și editarea ARN) este un modulator cheie post-transcripțional al expresiei genelor. MiARN-uri similare care concurează pentru aceeași țintă sunt potențiali transregulatori ai interacțiunilor ARN-ARN și ARN-proteină.

La animale, miARN-urile sunt cel mai bine studiate la nematodul Caenorhabditis Elegans; au fost descrise mai mult de 112 gene. Mii de siRNA-uri endogene (fără gene; asociate, în special, cu transcrie și transpozoni mediate de spermatogeneză) se găsesc și aici. Ambele ARN-uri mici ale metazoarelor pot fi generate de ARN polimeraze care prezintă activitatea (nu omologie) a RdRP-II (ca pentru majoritatea celorlalți ARN) și a tipurilor RdRP-III. ARN-urile mici maturi sunt similare ca compoziție (inclusiv 5"-fosfați terminali și 3"-OH), lungime (de obicei 21-22 nucleotide) și funcție și pot concura pentru aceeași țintă. Cu toate acestea, degradarea ARN, chiar și cu complementaritatea țintă completă, este mai des asociată cu siARN; represiune translațională, cu nucleotide parțiale, de obicei 5-6, complementaritate - cu miARN; iar precursorii, respectiv, sunt exo-/endogeni (sute/mii de nucleotide) pentru ARNsi și, de obicei, endogeni (zeci/sute de nucleotide) pentru miARN și biogeneza lor este diferită; cu toate acestea, în unele sisteme aceste diferențe sunt reversibile.

ARNi, mediat de siARN și miARN, are o varietate de roluri naturale: de la reglarea expresiei genelor și heterocromatinei până la protecția genomului împotriva transpozonilor și virușilor; dar siARN-urile și unele miARN-uri nu sunt conservate între specii. La plante (Arabidopsis thaliana) s-au găsit următoarele: siARN-uri corespunzătoare atât genelor, cât și regiunilor intergenice (inclusiv distanțiere, repetă); un număr mare de site-uri potenţiale ale genomului pentru tipuri variate ARN-uri mici. Nematodele au, de asemenea, așa-numitele 21U-ARN-uri exprimate autonom variabil (dasRNAs); au un 5"-Y-monofosfat, cuprind 21 de nucleotide (20 dintre ele sunt variabile) și sunt situate între sau în interiorul intronilor genelor care codifică proteine la mai mult de 5700 de situsuri în două regiuni ale cromozomului IV.

MiRNA-urile joacă rol important cu expresia genelor în condiții normale și patologice; la om există cel puţin 450-500 de astfel de gene. De obicei, legându-se de regiunile 3"-UTR ale ARNm (alte ținte), acestea pot bloca în mod selectiv și cantitativ (în special atunci când se elimină din circulație produsele unor gene slab exprimate) activitatea unor gene și activitatea altor gene. s-a dovedit că seturile de profiluri ale micro-ARN-urilor exprimate (și țintele lor) se modifică dinamic în timpul ontogenezei, diferențierii celulare și tisulare. Aceste modificări sunt specifice, în special, în timpul cardiogenezei, procesului de optimizare a dimensiunii lungimii dendritelor. numărul de sinapse ale unei celule nervoase (cu participarea miRNA-134, a altor ARN mici, dezvoltarea multor patologii (oncogeneză, imunodeficiențe, boli genetice, parkinsonism, boala Alzheimer, tulburări oftalmologice (retinoblastom etc.) asociate cu infecții). de diferite naturi).

Analiza computațională prezice sute de ținte ARNm pentru miARN-uri individuale și reglarea ARNm-urilor individuale de către miARN-uri multiple. Astfel, miARN-urile pot servi scopului de a elimina transcriptele genelor țintă sau de a ajusta expresia acestora la niveluri transcripționale/translaționale. Considerațiile teoretice și rezultatele experimentale susțin existența unor roluri diverse ale miARN-urilor.

O listă mai completă de aspecte legate de rolul fundamental al ARN-urilor mici la eucariote în procesele de creștere/dezvoltare și în unele patologii (inclusiv epigenomica cancerului) este reflectată în revizuire.

ARN-uri mici în oncologie

Procesele de creștere, dezvoltare, progresie și metastazare a tumorilor sunt însoțite de multe modificări epigenetice care se dezvoltă în modificări genetice mai rare, persistente ereditare. Mutațiile rare pot avea însă o greutate mare (pentru un anumit individ, nosologie), deoarece în raport cu genele individuale (de exemplu APC, K-ras, p53) așa-numitele efectul „pâlnie” asociat cu dezvoltarea/consecințele aproape ireversibile ale cancerului. Eterogenitatea specifică tumorii celulelor progenitoare în ceea ce privește profilul de expresie al diferitelor gene (proteine, ARN, ARN mici) este determinată de variațiile asociate ale structurilor epigenomice restructurate. Epigenomul este modulat prin metilare, modificări/înlocuiri post-translaționale ale histonelor (cu altele non-canonice), remodelare a structurii nucleozomale a genelor/cromatinei (inclusiv amprentarea genomică, adică disfuncția expresiei alelelor genelor parentale și cromozomilor X). ). Toate acestea, și cu participarea ARNi reglată de ARN-uri mici, conduc la apariția unor structuri heterocromatice defecte (inclusiv centromerice hipometilate).

Formarea mutațiilor specifice genelor poate fi precedată de acumularea cunoscută a sute de mii de mutații clonale somatice în repetări simple sau microsateliți ai unei regiuni necodificatoare (rar codificatoare) - cel puțin în tumorile cu fenotip mutator microsatelit (MMP) ; ele alcătuiesc o parte semnificativă a cancerelor colorectale, precum și cele pulmonare, stomacale, endometriale etc. Repetările instabile ale microsateliților mono-/heteronucleotidici (poli-A6-10, similar) sunt conținute de multe ori mai des în genele regulatoare necodificatoare care controlează expresia (introni, intergenic) decât în regiunile de codificare (exon) ale genomului tumorilor microsatelit-instabile, MSI+. Deși natura apariției și mecanismele de localizare a regiunilor MS-stabile/instabile nu sunt complet clare, formarea instabilității MS s-a corelat cu frecvența mutațiilor multor gene care nu au fost modificate anterior în tumorile MSI+ și, probabil, au canalizat căile de progresia lor; Mai mult, frecvența mutațiilor repetate MSI în aceste tumori a crescut cu mai mult de două ordine de mărime. Nu toate genele au fost analizate pentru prezența repetărilor, dar gradul lor de mutabilitate în regiunile codificante/necodificatoare este diferit, iar acuratețea metodelor de determinare a frecvenței mutațiilor este relativă. Este important ca regiunile necodificatoare ale repetițiilor mutabile MSI să fie adesea bialelice, în timp ce regiunile de codificare sunt monoalelice.

O scădere globală a metilării în tumori este tipică pentru elemente repetate, transpozabile (TE; transcripția lor crește), promotori, situsuri CpG ale genelor miARN supresoare de tumori și se corelează cu hipertranscripția retrotranspozonilor în celulele canceroase progresive. În mod normal, fluctuațiile „metilomului” sunt asociate cu „unde de metilare” specifice părintelui/stadiului/țesutului și metilare puternică a regiunilor satelite centromerice ale heterocromatinei, reglementate de ARN-uri mici. Când sateliții sunt submetilați, instabilitatea cromozomală rezultată este însoțită de o recombinare crescută, iar întreruperea metilării ME poate declanșa exprimarea acestora. Acești factori favorizează dezvoltarea unui fenotip tumoral. Terapia cu ARN mic poate fi foarte specifică, dar trebuie controlată deoarece țintele pot fi nu numai individuale, ci și multe molecule de ARNm/ARN și ARN-uri proaspăt sintetizate din diferite regiuni (inclusiv repetiții intergenice necodificatoare) ale cromozomilor.

Cea mai mare parte a genomului uman este alcătuită din repetări și ME. Retrotransposonul L1 (element LINE) conține, ca și retrovirusurile endogene, reversease (RTază), endonuclează și este potențial capabil să transfere retroelemente neautonome (Alu, SVA, etc.); tăcere a elementelor L1/like are loc ca urmare a metilării la situsurile CpG. Rețineți că printre situsurile CpG ale genomului, insulele CpG ale promotorilor genei sunt slab metilate, iar 5-metilcitozina în sine este o bază potențial mutagenă, dezaminată în timină (chimic, sau cu participarea editării ARN/(ADN), ADN-ul). reparație); cu toate acestea, unele dintre insulele CpG sunt supuse unei metilări aberante excesive, însoțite de reprimarea genelor supresoare și dezvoltarea cancerului. În continuare: proteina de legare a ARN codificată de L1, interacționând cu proteinele AGO2 (familia Argo-naute) și FMRP (proteina fragilă de retard mental, proteină a complexului efector RISC), promovează mișcarea elementului L1 - ceea ce indică o posibilă reglarea reciprocă a sistemelor ARNi și retropunerea elementelor LINE umane. Este important, în special, că repetele Alu sunt capabile să se deplaseze în regiunea intron/exon a genelor.

Acestea și mecanismele similare pot spori plasticitatea patologică a genomului celulei tumorale. Suprimarea RTazei (codificată, ca și endonucleaza, de elemente L1; RTază este, de asemenea, codificată de retrovirusuri endogene) prin mecanismul ARNi a fost însoțită de o scădere a proliferării și diferențiere crescută într-un număr de linii celulare canceroase. Când elementul L1 a fost introdus într-o genă proto-oncogenă sau supresoare, s-au observat rupturi duble catene ale ADN-ului. În țesuturile germinale (șoareci/uman), nivelul de expresie al L1 a fost crescut, iar metilarea acestuia a depins de sistemul de tăcere asociat piRNAs-(26-30-bp), unde proteinele PIWI sunt variante ale familiei mari de proteine Argo-naute. , mutații în care duc la demetilarea/deprimarea elementelor L1/like cu repetări terminale lungi. Proteinele PIWI, într-o măsură mai mare decât proteinele Dicer-1/2 și Ago, sunt asociate cu căile de tăcere rasiRNAs. Căile de tăcere mediate de piARN/siRNA-uri sunt realizate prin corpuri intranucleare care conțin complexe mari de PcG multiproteice conservate evolutiv, ale căror funcții sunt adesea afectate în celulele tumorale. Aceste complexe sunt responsabile pentru acțiunea pe distanță lungă (pe mai mult de 10 kb, între cromozomi) și reglează grupul de gene HOX responsabile de planul corpului.

Noile principii ale terapiei antisens pot fi dezvoltate ținând cont de cunoștințele despre agenți epigenomici antitumorali mai înalt specifici (decât inhibitorii modificatori de histonă ai ADN-ului/metilarea proteinelor), principiile fundamentale ale silenciării ARN epigenomic și rolul ARN-urilor mici în carcinogeneză.

Micro-ARN în oncologie

Se știe că creșterea crescută a tumorii și metastazele pot fi însoțite de o creștere a unora și o scădere a expresiei altor indivizi/seturi de miARN (Tabelul 1). Unele dintre ele pot avea un rol cauzal în tumorigeneză; și chiar și aceleași miARN (cum ar fi miR-21/-24) în diferite celule tumorale pot prezenta atât proprietăți oncogene, cât și de supresie. Fiecare tip de tumoră malignă umană se distinge în mod clar prin „amprenta sa digitală miARN”, iar unele miARN pot funcționa ca oncogene, supresoare de tumori, inițiatori ai migrației celulare, invaziei și metastazei. În țesuturile modificate patologic, se găsesc adesea cantități reduse de miARN-uri cheie implicate probabil în sistemele de apărare împotriva cancerului. MiRNA-urile (miRs) implicate în oncogeneză au format ideea așa-numitului. „oncomirah”: analiza exprimării a peste 200 de miARN în peste 1000 de mostre de limfoame și cancere solide a făcut posibilă clasificarea cu succes a tumorilor în subtipuri în funcție de originea și stadiul de diferențiere. Funcțiile și rolul miARN-urilor au fost studiate cu succes folosind: oligonucleotide anti-miR modificate (pentru a crește durata de viață) la grupările 2"-O-metil și 2"-O-metoxietil; precum și oligonucleotidele LNA, în care atomii de oxigen de riboză din pozițiile 2" și 4" sunt legați printr-o punte de metilen.

(Tabelul 1)……………….

Tumora	miARN-uri
Cancerul pulmonar	17-92 , lasă-7↓ , 124a↓ , 126 ↓ , 143 ↓ , 145 ↓ , 155 , 191 , 205 , 210
Cancer mamar	21 , 125b↓ , 145 ↓ , 155
Cancer de prostată	15a ↓ , 16-1 ↓ , 21 , 143 ↓ ,145 ↓
Cancer intestinal	19a , 21 , 143 ↓ , 145 ↓
Cancer de pancreas	21 , 103 , 107 , 155 v
Cancer ovarian	210
Leucemie limfocitară cronică	15a ↓ , 16-1 ↓ , 16-2 , 23 b , 24-1 , 29 ↓ , 146 , 155 , 195 , 221 , 223 ↓

tabelul 1 .

miARN a căror expresie crește () sau scade ( ↓ ) în unele dintre cele mai frecvente tumori în comparație cu țesuturile normale (vezi și, de asemenea).

Se crede că rolul reglator al expresiei, dispariției și amplificării genelor miARN în susceptibilitatea la inițierea, creșterea și progresia majorității tumorilor este semnificativ, iar mutațiile în perechile miARN/mARN țintă sunt sincronizate. Profilul de expresie al miARN-urilor poate fi utilizat pentru clasificare, diagnostic și prognostic clinic în oncologie. Modificările în expresia miARN-urilor pot afecta ciclul celular, programul de supraviețuire al celulei. Mutațiile miARN-urilor în celulele stem și somatice (precum și alegerea variantelor polimorfe ale țintelor ARNm) pot contribui sau chiar pot juca un rol critic în creșterea, progresia și patofiziologia multor (dacă nu a tuturor) afecțiunilor maligne. Cu ajutorul miARN-urilor, este posibilă corectarea apoptozei.

În plus față de miARN-urile individuale, au fost descoperite grupuri dintre aceștia, acționând ca o oncogenă care provoacă dezvoltarea, în special, a cancerului de țesut hematopoietic la șoarecii experimentali; Genele miARN cu proprietăți oncogene și supresoare pot fi localizate în același cluster. Analiza grupată a profilurilor de expresie a miARN-urilor în tumori face posibilă determinarea originii acesteia (epiteliu, țesut hematopoietic etc.) și clasificarea diferitelor tumori ale aceluiași țesut cu mecanisme de transformare neidentice. Evaluarea profilului de expresie al miARN-urilor poate fi efectuată folosind nano-/microarrays; Precizia unei astfel de clasificări, atunci când se dezvoltă tehnologia (ceea ce nu este ușor), se dovedește a fi mai mare decât utilizarea profilurilor ARNm. Unele dintre miARN sunt implicate în diferențierea celulelor hematopoietice (șoarece, om), inițierea progresiei celulelor canceroase. Genele miARN umane sunt adesea localizate în așa-numitele. Situri „fragile”, zone cu predominanță de deleții/inserții, rupturi de puncte, translocații, transpoziții, regiuni de heterocromatine minim șters și amplificate implicate în oncogeneză.

Angiogeneza . Rolul miARN-urilor în angiogeneză este probabil semnificativ. Creșterea angiogenezei în unele adenocarcinoame umane activate de Myc a fost însoțită de modificări ale modelului de expresie al unor miARN-uri, iar distrugerea genelor a altor miARN a condus la slăbirea și suprimarea creșterii tumorii. Creșterea tumorii a fost însoțită de mutații ale genelor K-ras, Myc și TP53, creșterea producției de factor angiogenic VEGF și gradul de vascularizare asociată cu Myc; în timp ce factorii antiangiogenici Tsp1 și CTGF au fost suprimați de miR-17-92 și de alte miARN-uri asociate cluster-ului. Angiogeneza și vascularizarea tumorii au fost îmbunătățite (în special în colonocite) prin coexprimarea a două oncogene mai degrabă decât a uneia.

Neutralizarea factorului antiangiogenic LATS2, un inhibitor al kinazei dependente de ciclină animală (CDK2; om/șoarece), cu miARN-372/373 („oncogene potențiale”) a stimulat creșterea tumorii testiculare fără a deteriora gena p53.

Modulatori potențiali ai proprietăților angiogene (in-vitro/in-vivo) sunt miR-221/222, ale căror ținte, receptorii c-Kit (alții), sunt factori de angiogeneză ai celulelor HUVEC venoase endoteliale ale cordonului ombilical etc. Aceste miARN și c-Kit interacționează ca parte a unui ciclu complex care controlează capacitatea celulelor endoteliale de a forma capilare noi.

Leucemie limfocitară cronică (LLC). În leucemia limfocitară cronică cu celule B (LLC), se observă un nivel redus de expresie genică miR-15a/miR-16-1 (și altele) în regiunea 13q14 a cromozomului uman - locul celor mai frecvente anomalii structurale ( inclusiv deleții ale regiunii de 30 kb), deși genomul a exprimat sute de maturi și pre-miARN-uri umane. Ambele miARN, potențial eficiente în terapia tumorală, au conținut regiuni antisens ale proteinei antiapoptotice Bcl2, au suprimat supraexpresia acesteia, au stimulat apoptoza, dar au fost aproape/complet absente în două treimi din celulele CLL „deviante”. Mutațiile frecvente ale miARN-urilor secvențiate în celulele stem/somatice au fost identificate la 11 din 75 de pacienți (14,7%) cu predispoziție familială la LLC (mod de moștenire necunoscut), dar nu la 160 de pacienți sănătoși. Aceste observații ridică speculații cu privire la funcționarea directă a miARN-urilor în leucemogeneză. În prezent, nu se știe totul despre relația dintre nivelurile de expresie genică ale miARN-urilor (și funcțiile acestora) și alte gene din celulele normale/tumorale.

Document

Relevanţă. Disfuncția nervului facial în timpul intervenției chirurgicale pe glanda salivară parotidă este una dintre cele problemele actualeși este determinată atât de prevalența bolii, cât și de frecvența semnificativă

Biserica Dawson - geniul este în genele tale medicina epigenetică și noua biologie a intențiilor carte din bibliotecă www e - puzzle ru carte din bibliotecă www e - puzzle ru cuprins

Carte

Etica spiritualitate oncologie hiv p garyaev* un rezumat enfi

Document

Acest articol reflectă o nouă perspectivă asupra problemei oncologiei și infecției cu HIV în lumina Geneticii undelor lingvistice (LWG) și a Teoriei Codării Esenței (ESC) bazată pe realitățile rusești și pe alte realități socio-culturale.

Centrul de Cercetare Oncologică și Blokhina Odintsova Anastasia Sergeevna noi scheme de chimioterapie pentru cancerul de col uterin avansat și recurent 14.01.12 – oncologie

teză

4.4. Determinarea genei izoenzimei uridin glucoronil transferazei (UGT1A1) în serul sanguin al pacienților cu cancer de col uterin care au primit chimioterapie de primă linie cu irinotecan cu derivați de platină 105

Lungimea siARN este de 21-25 bp, ele sunt formate din dsARN. Sursa unor astfel de ARN-uri pot fi infecții virale, constructe genetice introduse în genom, ac de păr lungi în transcrieri și transcrierea bidirecțională a elementelor mobile.
ARNds este tăiat de RNase Dicer în fragmente lungi de 21-25 bp. cu capete de 3" proeminente de 2 nucleotide, după care unul dintre lanțuri face parte din RISC și direcționează tăierea ARN-urilor omoloage. RISC conține siRNA-uri corespunzătoare atât catenelor plus, cât și minus de dsRNA. siRNA-urile nu au propriile gene și reprezintă sunt fragmente de ARN-uri mai lungi direcționează tăierea ARN-ului țintă, deoarece sunt complet complementare cu acesta. În plante, ciuperci și nematozi, ARN-polimerazele sunt implicate în procesul de suprimare a exprimării genelor, pentru care și ARNsi-urile servesc. primeri (primeri pentru sinteza noului ARN).

interferența ARN

În 1998, Craig C. Mello și Andrew Fire au publicat în Nature, care a declarat că ARN-ul dublu catenar (dsRNA) este capabil să reprima expresia genelor. Mai târziu s-a dovedit că principiul activ în acest proces este ARN monocatenar scurt. Se numește mecanismul de suprimare a expresiei genelor folosind aceste ARN
interferența ARN, precum și tăcere ARN. Acest mecanism se găsește în toți taxonii mari de eucariote: vertebrate și nevertebrate, plante și ciuperci. În 2006, a primit Premiul Nobel pentru această descoperire.
Suprimarea expresiei poate avea loc la nivel transcripțional sau post-transcripțional. S-a dovedit că în toate cazurile sunt necesare un set similar de proteine și ARN-uri scurte (21-32 bp).
siRNA-urile reglează activitatea genelor în două moduri. După cum sa menționat mai sus, ele direcționează tăierea ARN-urilor țintă. Acest fenomen se numește „suprimare” ( înăbușind) în ciuperci, " tăcere genică post-translațională„în plante și” interferența ARN „la animale. siRNA-urile lungi de 21-23 bp sunt implicate în aceste procese. Un alt tip de efect este că siARN-urile pot suprima transcrierea genelor care conțin secvențe omoloage de siARN. Acest fenomen a fost numit tăcere a genelor transcripționale (TGS) și se găsește în drojdii, plante și animale. ARNsi direcționează, de asemenea, metilarea ADN-ului, ceea ce duce la formarea heterocromatinei și la reprimarea transcripției. TGS este cel mai bine studiat în drojdia S. pombe, unde ARNsi se găsește a fi integrat într-un complex de proteine asemănător RISC numit RITS. În cazul lui, ca și în cazul RISC, siRNA interacționează cu o proteină din familia AGO. Este probabil ca ARNsi să fie capabil să direcționeze acest complex către o genă care conține un fragment de ARNsi omolog. După aceasta, proteinele RITS recrutează metiltransferaze, în urma cărora se formează heterocromatina în locusul care codifică gena țintă siRNA și expresia genei active încetează.

Rolul în procesele celulare

Care este semnificația ARNsi într-o celulă?
siRNA-urile sunt implicate în protecția celulelor împotriva virușilor, reprimarea transgenelor, reglarea anumitor gene și formarea heterocromatinei centromerice. O funcție importantă a ARNsi este suprimarea exprimării elementelor genetice mobile. O astfel de suprimare poate apărea atât la nivel transcripțional, cât și posttranscripțional.
Genomul unor virusuri este format din ADN, în timp ce alții constau din ARN, iar ARN-ul virusurilor poate fi fie monocatenar, fie dublu. Procesul de tăiere a ARNm străin (viral) în acest caz are loc în același mod ca cel descris mai sus, adică prin activarea complexului enzimatic RISC. Cu toate acestea, pentru o mai mare eficiență, plantele și insectele au inventat o modalitate unică de a spori efectul protector al siARN. Prin unirea catenei de ARNm, o secțiune de ARNsi poate, cu ajutorul complexului enzimatic DICER, să completeze mai întâi a doua catenă de ARNm și apoi să o taie în locuri diferite, creând astfel o varietate de ARNsi „secundar”. Ei, la rândul lor, formează RISC și poartă ARNm prin toate etapele discutate mai sus, până la distrugerea sa completă. Astfel de molecule „secundare” se vor putea lega în mod specific nu numai de partea din ARNm viral către care a fost direcționată molecula „primară”, ci și de alte zone, ceea ce crește dramatic eficacitatea apărării celulare.

Astfel, în plante și organismele animale inferioare, siRNA-urile sunt o parte importantă a unui fel de „imunitate intracelulară” care le permite să recunoască și să distrugă rapid ARN-ul străin. Dacă un ARN care conține un virus a intrat în celulă, un astfel de sistem de protecție îl va împiedica să se înmulțească. Dacă virusul conține ADN, sistemul siRNA îl va împiedica să producă proteine virale (întrucât ARNm-ul necesar pentru aceasta va fi recunoscut și tăiat), iar utilizarea acestei strategii va încetini răspândirea acestuia în organism.

Mamiferele, spre deosebire de insecte și plante, au un sistem de apărare diferit. Când ARN străin, a cărui lungime este mai mare de 30 bp, intră într-o celulă de mamifer „matură” (diferențiată), celula începe să sintetizeze interferonul. Interferonul, prin legarea de receptori specifici de pe suprafața celulei, este capabil să stimuleze un întreg grup de gene din celulă. Ca rezultat, în celulă sunt sintetizate mai multe tipuri de enzime, care inhibă sinteza proteinelor și descompun ARN-ul viral. În plus, interferonul poate acționa și asupra celulelor vecine, încă neinfectate, blocând astfel posibila răspândire a virusului.

După cum puteți vedea, ambele sisteme sunt similare în multe privințe: au un scop comun și „metode” de lucru. Chiar și denumirile „interferon” și „interferență (ARN)” provin de la o rădăcină comună. Dar au și o diferență foarte semnificativă: dacă interferonul, la primele semne de invazie, pur și simplu „îngheață” activitatea celulei, nepermițând (doar în eventualitatea) producerea multor, inclusiv a proteinelor „inocente” în celulă, atunci sistemul siARN este extrem de inteligibil: Fiecare siARN va recunoaște și va distruge doar propriul ARNm specific. Înlocuirea unei singure nucleotide în siRNA duce la o scădere bruscă a efectului de interferență . Niciunul dintre blocanții genici cunoscuți până acum nu are o specificitate atât de excepțională pentru gena țintă.

Descoperirea interferenței ARN a dat noi speranțe în lupta împotriva SIDA și cancerului. Este posibil ca prin utilizarea terapiei cu siARN împreună cu terapia antiviral tradițională, să se poată obține un efect de potențare, unde cele două tratamente au ca rezultat un efect terapeutic mai mare decât suma simplă a fiecăruia dată separat.
Pentru a utiliza mecanismul de interferență cu siARN în celulele de mamifere, moleculele de siARN dublu catenar gata făcute trebuie introduse în celule. Dimensiunea optimă a unui astfel de ARNsi sintetic este aceeași 21-28 de nucleotide. Dacă îi creșteți lungimea, celulele vor răspunde producând interferon și reducând sinteza proteinelor. SiRNA-urile sintetice pot intra atât în celulele infectate, cât și în cele sănătoase, iar o scădere a producției de proteine în celulele neinfectate ar fi extrem de nedorită. Pe de altă parte, dacă încercați să utilizați ARNsi mai mic de 21 de nucleotide, specificitatea legării sale la ARNm dorit și capacitatea de a forma complexul RISC scad brusc.

Dacă este posibil să se livreze ARNsi într-un fel sau altul care are capacitatea de a se lega de orice parte a genomului HIV (care, după cum se știe, constă din ARN), se poate încerca să împiedice integrarea acestuia în ADN-ul gazdei. celulă. În plus, oamenii de știință dezvoltă modalități de a influența diferitele etape ale reproducerii HIV într-o celulă deja infectată. Această ultimă abordare nu va oferi un leac, dar poate reduce semnificativ rata de reproducere a virusului și poate oferi sistemului imunitar încolțit șansa de a se „odihnește” de atacul viral și de a încerca să facă față rămășițelor bolii în sine. În figură, cele două etape ale reproducerii HIV într-o celulă, despre care oamenii de știință speră că pot fi blocate folosind siARN, sunt marcate cu cruci roșii (etapele 4-5 - integrarea virusului în cromozom și etapele 5-6 - asamblarea virusul și ieșirea din celulă).

Astăzi, însă, toate cele de mai sus se referă doar la domeniul teoriei. În practică, terapia cu siRNA întâmpină dificultăți pe care oamenii de știință nu au reușit încă să le depășească. De exemplu, în cazul terapiei antivirale, specificitatea ridicată a siRNA este cea care poate juca o glumă crudă: după cum se știe, virușii au capacitatea de a muta rapid, de exemplu. modifică compoziția nucleotidelor sale. HIV a avut un succes deosebit în acest sens, frecvența schimbărilor în care este astfel încât o persoană infectată cu un subtip de virus poate, după câțiva ani, să dezvolte un subtip complet diferit. În acest caz, tulpina HIV modificată va deveni automat insensibilă la siARN selectat la începutul terapiei.

Îmbătrânirea și carcinogeneza

Ca orice factor epigenetic, siRNA-urile afectează expresia genelor care sunt reduse la tăcere. Acum există lucrări care descriu experimente privind dezactivarea genelor asociate cu tumori. Genele sunt oprite (knock-down) folosind siRNA. De exemplu, oamenii de știință chinezi au folosit siRNA pentru a opri gena factorului de transcripție 4 (TCF4), a cărei activitate provoacă sindromul Pitt-Hopkins (o boală genetică foarte rară caracterizată prin retard mintal și episoade de hiperventilație și apnee) și alte boli psihice. În această lucrare, am studiat rolul TCF4 în celulele canceroase gastrice. Expresia ectopică a TCF4 reduce creșterea celulară în liniile celulare de cancer gastric, eliminând gena TCF4 folosind siRNA crește migrația celulară. Astfel, putem concluziona că oprirea epigenetică (tacere) a genei TCF4 joacă un rol important în formarea și dezvoltarea tumorilor.

Potrivit cercetărilor din cadrul Departamentului de Oncologie, Albert Einstein Cancer Center, condus de Leonard H. Augenlicht, siRNA este implicat în oprirea genei HDAC4, care provoacă inhibarea creșterii cancerului de colon, apoptoza și creșterea transcripției p21. HDAC4 este o histonă deacetilază care este specifică țesutului, inhibă diferențierea celulară și expresia sa este suprimată în timpul procesului de diferențiere celulară. Lucrarea arată că HDAC4 este un regulator important al proliferării celulelor de colon (care este importantă în procesul cancerului) și, la rândul său, este reglementat de ARNsi.

Departamentul de Patologie, Nara Medical University School of Medicine din Japonia a efectuat cercetări privind cancerul de prostată. Îmbătrânirea celulară replicativă este o barieră împotriva diviziunii necontrolate și a carcinogenezei. Celulele de diviziune cu viață scurtă (TAC) fac parte din populația de celule de prostată din care se formează tumorile. Oamenii de știință japonezi au studiat motivele pentru care aceste celule depășesc îmbătrânirea. Celulele de prostată din cultură au fost transfectate cu ARNsi junB. Aceste celule prezintă niveluri crescute de expresie ale p53, p21, p16 și pRb, care sunt detectate în timpul îmbătrânirii. Celulele din cultură care au prezentat niveluri reduse de p16 au fost utilizate pentru etapa următoare. Transfecția repetată a ARNsi în TAC a permis celulelor să evite senescența la inactivarea p16/pRb. În plus, tăcere a proto-oncogenei junB de către ARNsi junB provoacă invazia celulară. Pe baza acestui fapt, s-a ajuns la concluzia că junB este un element pentru p16 și promovează senescența celulară, prevenind malignitatea TAC. Astfel, junB este un regulator al carcinogenezei prostatei și poate fi o țintă pentru intervenția terapeutică. Și activitatea sa poate fi reglată folosind siRNA.

Sunt în curs de desfășurare o mulțime de studii similare. În prezent, siRNA nu este doar un obiect, ci și un instrument în mâinile unui cercetător - medic, biolog, oncolog, gerontolog. Studierea conexiunii dintre siRNA și cancer și expresia genelor asociate vârstei este cea mai importantă sarcină pentru știință. A trecut foarte puțin timp de la descoperirea siRNA, dar au apărut multe studii și publicații interesante legate de acestea. Nu există nicio îndoială că studiul lor va fi unul dintre pașii umanității către victoria asupra cancerului și îmbătrânirii...