Studierea inhibării activității enzimelor este una dintre modalitățile de a descifra mecanismul acțiunii lor. O abordare pentru rezolvarea ultimei probleme este studierea specificului acțiunii enzimelor. La rândul său, acest lucru necesită măsurarea corectă a parametrilor cinetici în prezența analogului substratului studiat. Să luăm în considerare modalități de a determina natura relatiei substraturi, analogii și inhibitorii acestora activitate enzimatică prin calcularea unui număr de parametri cinetici.
Mai mult, dacă constanta de disociere a complexului K s = K m este egală cu:
Inhibitori enzimele pot fi împărțite în două grupe principale: reversibilŞi ireversibil. După îndepărtarea primului inhibitor de tip, activitatea enzimatică este restabilită; în al doilea caz, inhibitorul nu poate fi îndepărtat sau activitatea enzimatică nu este restabilită nici după îndepărtarea inhibitorului. Inhibarea ireversibilă este maximă atunci când întreaga enzimă este legată de inhibitor. Inhibarea reversibilă atinge o stare de echilibru, a cărei poziție este determinată de constanta de inhibitie, care caracterizează afinitatea enzimei pentru inhibitor. Schema de inhibiție reversibilă este prezentată mai jos:
În inhibarea competitivă, substratul și inhibitorul se leagă de același loc activ al enzimei. În prezența unui inhibitor, afinitatea enzimei pentru substrat scade. Valoarea nu se modifică, deoarece la o concentrație „saturatoare”, substratul înlocuiește inhibitorul din complexul cu enzima.
La inhibiție necompetitivă substratul și inhibitorul se leagă de diferite locuri ale enzimei. În acest caz, valoarea lui K ha nu se modifică, iar valoarea lui V max scade.
Sunt posibile și cazuri intermediare sau alternative, de exemplu, atunci când inhibitorul se leagă nu de enzimă, ci de complexul enzimă-substrat, ca în cazul necompetitiv inhibiție, în care ambii parametri cinetici se modifică.
Pentru a determina tipul de inhibiție, se utilizează de obicei o diagramă Lineweaver-Burk, obținută pentru un substrat dat în absența și prezența unui inhibitor.
În cazul inhibiției competitive, dacă se determină valoarea Kt în prezența unui inhibitor, constanta de inhibiție poate fi calculată folosind următoarea formulă:
În cazul inhibiției necompetitive, prin determinarea valorii modificate a lui V, K poate fi calculat folosind următoarea formulă:
Toate procesele biochimice dintr-o celulă sunt interconectate și interdependente, cu toate acestea, unele dintre ele îndeplinesc în primul rând funcția de a construi material celular, iar unele dintre ele furnizează surse de energie acestor „ lucrari de constructii" Prin urmare, se obișnuiește să se împartă procesele biochimice în două tipuri principale: asimilare, numit anabolism, inclusiv sinteza precursorilor cu greutate moleculară mică și construcția de molecule de biopolimer din aceștia și disimilare, numit catabolism, constând în furnizarea unei surse de energie, un „impuls energetic” care conduce anabolismul.
Să luăm în considerare mecanismele de bază ale proceselor de transformare a energiei în celulă, adică. mecanismele proceselor catabolice.
Se face o distincție între inhibarea reversibilă și ireversibilă. Dacă un inhibitor provoacă modificări persistente în structura terțiară spațială a moleculei de enzimă sau modificarea grupelor funcționale ale enzimei, atunci acest tip de inhibiție se numește ireversibilă. Mai des, însă, apare o inhibiție reversibilă, care poate fi cuantificată folosind ecuația Michaelis-Menten. Inhibarea reversibilă, la rândul ei, se împarte în competitivă și necompetitivă, în funcție de faptul că este posibilă sau nu depășirea inhibării reacției enzimatice prin creșterea concentrației substratului.
Inhibarea competitivă poate fi cauzată de substanțe având o structură similară cu cea a substratului, dar ușor diferită de structura substratului adevărat. Această inhibare se bazează pe legarea inhibitorului la situsul (activ) de legare a substratului. Exemplu clasic Un tip similar de inhibiție este inhibarea succinat dehidrogenazei (SDH) de către acidul malonic. Această enzimă catalizează oxidarea prin dehidrogenarea acidului succinic (succinat) în acid fumaric:
Dacă în mediu se adaugă malonat (inhibitor), ca urmare a asemănării sale structurale cu adevăratul substrat succinat (prezența a două dintre aceleași grupări carboxil ionizate), acesta va interacționa cu centrul activ pentru a forma un inhibitor enzimatic. complex, cu toate acestea, transferul unui atom de hidrogen din malonat este complet eliminat. Structurile substratului (succinat) și inhibitorului (malonat) sunt încă oarecum diferite. Prin urmare, ei concurează pentru legarea la locul activ, iar gradul de inhibare va fi determinat de raportul dintre concentrațiile de malonat și succinat, și nu de concentrația absolută a inhibitorului. Astfel, inhibitorul se poate lega reversibil de sferm, formând un complex enzimă-inhibitor. Acest tip de inhibiție este uneori numit inhibiție a antagonismului metabolic (Fig. 4.20).
ÎN forma generala reacția dintre inhibitor și enzimă poate fi reprezentată prin următoarea ecuație:
Complexul rezultat, numit complex enzimă-inhibitor EI, spre deosebire de complexul enzimă-substrat ES, nu se descompune pentru a forma produși de reacție. Constanta de disociere a complexului EI sau constanta inhibitorie Ki poate fi definită, conform teoriei Michaelis–Menten, ca raportul constantelor reacțiilor inverse și directe:
Metoda inhibiției competitive și-a găsit o largă aplicare în practica medicală. Se știe, de exemplu, că medicamentele sulfonamide sunt folosite pentru a trata anumite boli infecțioase cauzate de bacterii. S-a dovedit că aceste medicamente sunt similare structural cu acidul para-aminobenzoic, care celula bacteriana utilizat pentru sinteza acidului folic, care este o parte integrantă
Orez. 4.20. Acțiunea unui inhibitor competitiv (schemă conform V.L. Kretovich). E - enzimă; S - substrat; P 1 şi P 2 - produşi de reacţie; I - inhibitor.
enzime bacteriene. Datorită acestei asemănări structurale, sulfonamida blochează acțiunea enzimei prin deplasarea acidului para-aminobenzoic din complexul cu enzima care sintetizează acidul folic, ceea ce duce la inhibarea creșterii bacteriene.
Inhibarea necompetitivă este cauzată de substanțe care nu sunt similare structural cu substraturile și adesea se leagă nu de centrul activ, ci în altă parte a moleculei enzimatice. Gradul de inhibiție în multe cazuri este determinat de durata de acțiune a inhibitorului asupra enzimei. Cu acest tip de inhibiție, datorită formării unui grajd legătură covalentă enzima suferă adesea o inactivare completă, iar apoi inhibarea devine ireversibilă. Un exemplu de inhibare ireversibilă este efectul iodoacetatului, DPP, precum și al fosfatului de dietil-n-nitrofenil și al sărurilor acidului cianhidric. Această acțiune constă în legarea și oprirea grupărilor funcționale sau ionilor metalici și a moleculei de enzimă.
Proteoliză limitată.
Reglarea activității de către hormoni.
Reglarea hormonală se realizează la nivel genetic prin fosforilare reversibilă. De exemplu, sub influența adrenalinei, are loc procesul de descompunere a glicogenului. În timpul acestui proces, se formează un compus non-proteic - y-AMP. γ-AMP este un hormon intracelular (al doilea mesager) și este un regulator alosteric al unui număr mare de proteine lipaze. γ-AMP se formează din ATP prin acțiunea adenilat-ciclazelor.
Reglarea activității prin modificare chimică.
Modificare chimică- atașarea oricăror grupări funcționale la enzimă, cu o modificare ulterioară a activității acesteia. Modificarea chimică este reversibilă. De exemplu, enzimele cheie ale metabolismului energetic - fosforilaza, glicogen sintaza sunt controlate de fosforilarea și defosforilarea efectuate de enzime specifice - proteinilază și fosfotaza. Iar nivelul de activitate al enzimelor cheie va fi determinat de raportul dintre formele fosforilate și defosforilate ale acestor enzime.
Toate enzimele gastrointestinale și pancreatice sunt sintetizate într-o formă inactivă ca proenzime. Reglementarea în acest caz se rezumă la transformarea lor într-o formă activă. De exemplu, activarea tripsinogenului are loc sub acțiunea enterokinazei și duce la scindarea secvențelor de aminoacizi în exces. În acest caz, se formează centrul activ și structura terțiară a tripsinei. Acest fenomen se numește proteoliză limitată . Lui semnificație biologică este că elimină autodigestia organului (autocataliza), care, de exemplu, apare atunci când tripsina este activată în pancreasul însuși. În al doilea rând, asigură o reglare mai fină a cantității de enzimă.
Proteoliza limitată este sub controlul factorilor de mediu, pH-ul și în celulă - sub controlul Ca.
Viteza reacției enzimatice este determinată de prezența efectorilor în mediu: activatori și inhibitori. Activatori crește viteza de reacție și uneori o modifică, iar inhibitorii o încetinesc.
Activatori: coenzime, ioni Me, reactivi SH. Efectul de activare este asociat cu optimizarea structurii moleculei proteice și a centrului activ al enzimei. Acest lucru îmbunătățește interacțiunea dintre enzimă și substrat.
Activator al lipazei pancreatice – acizi biliari.
Activator de tripsinogen - enterokinaza.
Activator chematripsinogen – tripsina.
Activatorul pepsinei și al amilazei sunt ionii de Ca.
Eu pot acționa și ca activatori:
Zn este un activator al anhidrazei carbonice.
Inhibitori Se obișnuiește să se numească o substanță care provoacă inhibarea parțială sau completă a unei reacții.
Orice agenți care provoacă denaturarea unei enzime sunt inhibitori. Cu toate acestea, o astfel de inhibare este nespecifică deoarece nu este legată de mecanismul de acțiune al enzimelor. Există mult mai mulți inhibitori specifici care acționează asupra unei enzime sau a unui grup de enzime înrudite. Astfel de inhibitori pot oferi informații valoroase despre natura situsului activ al enzimei. Mecanismul de acțiune al multor toxine și otrăvuri asupra organismului se bazează pe inhibarea enzimatică. Astfel, in cazul intoxicatiei cu acid cianhidric, apare spasmul datorita inhibarii complete a enzimelor respiratorii (citocrom oxidaza).
Tipuri de inhibiție:
1) Reversibilă
2) ireversibil
Dacă o moleculă inhibitoare provoacă modificări persistente sau modificarea centrului activ al enzimei, atunci așa tip de inhibiție numit ireversibil .
Inhibația reversibilă este mai frecventă și se împarte în competitivŞi necompetitiv, în funcție de dacă este posibilă sau nu depășirea inhibării reacției enzimatice prin creșterea (S). Inhibarea competitivă este posibilă dacă există similitudini structurale între substrat și inhibitor. De exemplu, inhibarea activității succinat dehidrogenazei de către acidul malonic:
NOOS - 2N NOOS
SN -------- SN
CH SDH CH
NOOS NOOS
fumarat succinat
Dacă în mediu se adaugă malonat în loc de succinat, atunci, datorită asemănării sale structurale cu succinatul, va reacționa cu centrul activ al LDH. Cu toate acestea, în acest caz, transferul de 2H din malonat nu are loc, deoarece structurile malonat și succinat sunt încă oarecum diferite și vor concura pentru legarea la centrul activ al SDH, iar gradul de inhibare va fi determinat de raport a concentraţiilor de malonat şi succinat. Particularitatea acestei inhibiții este reversibilitatea datorită creșterii (S).
I(+) E + I ------ EI
Adesea apare inhibarea parțial necompetitivă, în care o scădere a Vmax este combinată cu o creștere a Km. În cazuri rare, gradul de inhibare a activității enzimatice poate crește odată cu creșterea (S). Acesta este așa-numitul inhibiție necompetitivă . În acest caz, este posibil ca inhibitorul să se combine cu complexul ES, prin urmare, se formează un complex inactiv sau care reacţionează lent.
ES+I ------ESI
Acțiunea multor medicamente se bazează pe toate aceste metode de inhibiție. De exemplu, medicamentele sulfonamide sunt folosite pentru a trata anumite infecții care sunt similare structural cu PABA, pe care celula bacteriană îl folosește ca substrat pentru sinteza acidului folic. Datorită asemănării, sulfonamida blochează acțiunea enzimei prin deplasarea PABA din complexul ES, ceea ce duce la scăderea creșterii bacteriene. Acest inhibiție competitivă .
Toate reacțiile biochimice care apar în organism sunt supuse unui control specific, care se realizează printr-un efect de activare sau inhibitor asupra enzimelor de reglare. Acestea din urmă sunt de obicei la începutul lanțurilor de transformări metabolice și fie încep un proces în mai multe etape, fie îl inhibă. Unele reacții individuale sunt, de asemenea, supuse reglementării. Inhibarea competitivă este unul dintre principalele mecanisme de control al activității catalitice a enzimelor.
Mecanismul catalizei enzimatice se bazează pe legarea centrului activ al enzimei cu o moleculă substrat (complex ES), rezultând în reacție chimică cu formarea si eliberarea produsului (E+S = ES = EP = E+P).
Inhibarea enzimatică este o reducere a vitezei sau oprirea completă a procesului de cataliză. Într-un sens mai restrâns, acest termen înseamnă o scădere a afinității centrului activ pentru substrat, care se realizează prin legarea moleculelor de enzime de substanțe inhibitoare. Acesta din urmă poate acționa în diverse moduri, pe baza cărora sunt împărțite în mai multe tipuri, care corespund mecanismelor de inhibiție cu același nume.
Principalele tipuri de inhibiție
În funcție de natura procesului, inhibiția poate fi de două tipuri:
- Ireversibil - provoacă modificări permanente ale moleculei de enzimă, privând-o de activitate funcțională (cea din urmă nu poate fi restabilită). Poate fi atât specific, cât și nespecific. Inhibitorul se leagă strâns de enzimă prin interacțiune covalentă.
- Reversibil este principalul tip de reglare negativă a enzimelor. Se realizează datorită atașării specifice reversibile a inhibitorului la proteina enzimatică prin legături slabe necovalente, susceptibile de descriere cinetică conform ecuației Michaelis-Menten (excepția este reglarea alosterică).
Există două tipuri principale de inhibiție reversibilă a enzimelor: competitivă (poate fi slăbită prin creșterea concentrației de substrat) și necompetitivă. În acest din urmă caz, viteza maximă posibilă de cataliză scade.
Principala diferență dintre inhibiția competitivă și cea necompetitivă este locul în care substanța de reglementare se atașează de enzimă. În primul caz, inhibitorul se leagă direct la locul activ, iar în al doilea, la o altă parte a enzimei sau la complexul enzimă-substrat.
Există de asemenea tip mixt inhibiție, în care legarea la un inhibitor nu împiedică formarea ES, ci încetinește cataliza. În acest caz, substanța regulatoare face parte din complexe duble sau ternare (EI și EIS). În tipul necompetitiv, enzima se leagă numai de ES.
Caracteristici ale inhibiției reversibile a enzimelor competitive
Mecanismul competitiv de inhibiție se bazează pe asemănarea structurală a substanței de reglare cu substratul. Ca rezultat, se formează un complex al centrului activ cu inhibitorul, denumit în mod convențional EI.
Inhibarea competitivă reversibilă are următoarele caracteristici:
- legarea la inhibitor are loc în situsul activ;
- inactivarea moleculei de enzimă este reversibilă;
- efectul inhibitor poate fi redus prin creșterea concentrației de substrat;
- inhibitorul nu afectează viteza maximă de cataliză enzimatică;
- complexul EI se poate dezintegra, care se caracterizează printr-o constantă de disociere corespunzătoare.
Cu acest tip de reglare, inhibitorul și substratul par să concureze unul cu celălalt pentru un loc în centrul activ, de unde provine numele procesului.
Ca urmare, inhibiția competitivă poate fi definită ca un proces reversibil de inhibare a catalizei enzimatice, bazat pe afinitatea specifică a centrului activ pentru substanța inhibitoare.
Mecanismul de acțiune
Legarea inhibitorului la locul activ previne formarea complexului enzimă-substrat necesar catalizei. Ca urmare, molecula de enzimă devine inactivă. Cu toate acestea, centrul catalitic se poate lega nu numai de inhibitor, ci și de substrat. Probabilitatea formării unui anumit complex depinde de raportul de concentrație. Dacă există semnificativ mai multe molecule de substrat, enzima va reacționa cu ele mai des decât cu inhibitorul.
Efectul asupra vitezei unei reacții chimice
Gradul de inhibare a catalizei în timpul inhibării competitive este determinat de cantitatea de enzimă pe care o vor forma complecșii EI. În acest caz, este posibilă creșterea concentrației substratului într-o asemenea măsură încât rolul inhibitorului să fie deplasat, iar viteza de cataliză va atinge valoarea maximă posibilă corespunzătoare valorii lui V max conform Michaelis. -Ecuația Menten.
Acest fenomen se explică prin diluția puternică a inhibitorului. Ca urmare, probabilitatea ca moleculele de enzimă să se lege de acesta este redusă la zero, iar centrii activi reacţionează numai cu substratul.
Dependențe cinetice ale unei reacții enzimatice cu participarea unui inhibitor competitiv
Inhibarea competitivă crește constanta Michaelis (Km), care este egală cu concentrația de substrat necesară pentru a atinge ½ din viteza maximă de cataliză la începutul reacției. Cantitatea de enzimă ipotetic capabilă să intre în contact cu substratul rămâne constantă, iar numărul de complexe ES formate efectiv depinde doar de concentrația acestuia din urmă (complecșii EI nu sunt constanți și pot fi deplasați de substrat).
Inhibarea competitivă a enzimelor poate fi determinată cu ușurință din graficele de dependență cinetică reprezentate grafic pentru diferite concentrații de substrat. În acest caz, valoarea lui K m se va modifica, dar V max va rămâne constantă.
În cazul inhibiției necompetitive, opusul este adevărat: inhibitorul se leagă în afara locului activ și prezența substratului nu poate afecta în niciun fel acest lucru. Ca rezultat, unele molecule de enzime sunt „deconectate” de la cataliză, iar viteza maximă posibilă scade. Cu toate acestea, moleculele de enzime active se pot lega liber de substrat atât la concentrații scăzute, cât și la concentrații mari ale acestuia din urmă. Prin urmare, constanta Michaelis rămâne constantă.
Graficele inhibiției competitive în sistemul de coordonate duble inverse reprezintă mai multe drepte care intersectează axa ordonatelor în punctul 1/V max. Fiecare linie dreaptă corespunde unei anumite concentrații de substrat. Diferite puncte de intersecție cu axa x (1/[S]) indică o modificare a constantei Michaelis.
Efectul unui inhibitor competitiv folosind exemplul de malonat
Un exemplu tipic de inhibiție competitivă este procesul de reducere a activității succinat dehidroginazei, o enzimă care catalizează oxidarea acidului succinic (succinat) în acid fumaric. Malonatul, care este similar structural cu succinatul, acţionează aici ca un inhibitor.
Adăugarea unui inhibitor la mediu determină formarea de complexe de malonat cu succinat dehidrogenază. O astfel de legătură nu dăunează centrului activ, ci blochează accesibilitatea acestuia la acidul succinic. Creșterea concentrației de succinat reduce efectul inhibitor.
Utilizare în medicină
Mecanismul de inhibiție competitivă stă la baza acțiunii multor medicamente, care sunt analogi structurali ai substraturilor unor căi metabolice, a căror inhibare este o parte necesară a tratamentului bolilor.
De exemplu, pentru a îmbunătăți conducerea impulsurilor nervoase în distrofiile musculare, este necesară creșterea nivelului de acetilcolină. Acest lucru se realizează prin inhibarea activității acetilcolinesterazei care o hidrolizează. Bazele cuaternare de amoniu care fac parte din medicamente (prorezin, endrofoniu etc.) acţionează ca inhibitori.
Un grup special include antimetaboliți, care, pe lângă efectul lor inhibitor, prezintă proprietățile unui pseudosubstrat. În acest caz, formarea complexului EI duce la formarea unui produs anormal inert biologic. Antimetaboliții includ sulfonamide (utilizate în tratamentul infecțiilor bacteriene), analogi nucleotidici (utilizați pentru a opri creșterea celulară a unei tumori canceroase) etc.
Inhibarea competitivă: definiție, caracteristici și exemple - totul despre călătoria pe site
În anumite condiții, inhibitorul poate fi ușor separat de enzimă.
Inhibarea competitivă reversibilă
În acest caz, o substanță, similară ca structură cu substratul obișnuit al enzimei, se combină cu centrul activ al enzimei, dar nu poate reacționa cu acesta. Fiind aici, blochează accesul la centrul activ la orice moleculă a substratului real. Deoarece în acest caz inhibitorul și substratul concurează pentru spațiu pe locul activ al enzimei, această formă de inhibiție se numește inhibiție competitivă. Este reversibilă, deoarece pe măsură ce concentrația de substrat crește, viteza de reacție crește.
6.4. De ce va crește viteza de reacție în aceste condiții?
Orez. Figura 6.15 ilustrează un exemplu de inhibiție competitivă.
Fenomenul de inhibiție competitivă este utilizat în chimioterapie. Scopul chimioterapiei este de a distruge agentul cauzal al bolii folosind anumite substanțe chimice fără a deteriora țesuturile organismului gazdă. În timpul celui de-al Doilea Război Mondial, au fost utilizate pe scară largă pentru combaterea bolilor infecțioase. medicamente sulfa, sau sulfonamide, - derivați ai acidului sulfanilic. Sulfonamide în felul lor structura chimica sunt aproape de acidul para-aminobenzoic (PABA), un factor de creștere necesar pentru multe bacterii patogene. PABA este necesar de bacterii pentru sinteza acidului folic, care servește ca cofactor pentru enzimă. Efectul sulfonamidelor este asociat cu perturbarea sintezei acidului folic din PABA.
Celulele animale nu sunt sensibile la sulfonamide, deși au nevoie de acid folic pentru unele reacții. Acest lucru se explică prin faptul că folosesc acid folic transformat; calea metabolică care ar asigura sinteza acesteia este absentă la animale.
Inhibare reversibilă necompetitivă
Inhibitorii de acest fel nu au legătură ca structură cu substratul acestei enzime; În acest caz, nu centrul activ al enzimei este cel care participă la formarea complexului cu inhibitorul, ci o altă parte a moleculei sale (Fig. 6.16). Formarea complexului implică o modificare a structurii globulare a enzimei și, deși substratul real este încă atașat de enzimă, cataliza este totuși imposibilă. Un exemplu este cianura. Se leagă de ionii metalici care acționează ca o grupare protetică în unele enzime (în special, ionii de cupru ai citocrom oxidazei) și inhibă activitatea acestor enzime. Pe măsură ce concentrația inhibitorului crește, viteza reacției enzimatice scade din ce în ce mai mult. Până la momentul saturației cu inhibitorul, se dovedește a fi practic egal cu zero.
