Längden på siRNA är 21-25 bp, de bildas från dsRNA. Källan till sådana RNA kan vara virusinfektioner, genetiska konstruktioner som introduceras i genomet, långa hårnålar i transkript och dubbelriktad transkription av mobila element.
dsRNA skärs av RNase Dicer till fragment 21-25 bp långa. med 3" ändar som sticker ut med 2 nukleotider, varefter en av kedjorna är en del av RISC och styr skärningen av homologa RNA. RISC innehåller siRNA som motsvarar både plus- och minussträngar av dsRNA. siRNA har inte sina egna gener och representerar är fragment av längre RNA:er styr skärningen av mål-RNA:n, eftersom de är fullständigt komplementära till det. primers (primrar för syntes av nytt RNA). 
RNA-interferens
1998 publicerade Craig C. Mello och Andrew Fire i Nature, som påstod att dubbelsträngat RNA (dsRNA) kan undertrycka genuttryck. Senare visade det sig att den aktiva principen i denna process är kort enkelsträngat RNA. Mekanismen för undertryckande av genuttryck med användning av dessa RNA kallas
RNA-interferens, såväl som RNA-tystnad. Denna mekanism finns i alla stora taxa av eukaryoter: ryggradsdjur och ryggradslösa djur, växter och svampar. 2006 fick han Nobelpriset för denna upptäckt.
Undertryckande av uttryck kan ske på transkriptionsnivå eller posttranskriptionellt. Det visade sig att i alla fall krävs en liknande uppsättning proteiner och korta (21-32 bp) RNA.
siRNA reglerar genaktivitet på två sätt. Som nämnts ovan styr de skärningen av mål-RNA. Detta fenomen kallas "undertryckning" ( dämpa) i svamp, " post-translationell gentystnad"i växter och" RNA-interferens
"i djur. siRNA 21-23 bp långa är involverade i dessa processer. En annan typ av effekt är att siRNA kan undertrycka transkriptionen av gener som innehåller homologa siRNA-sekvenser. Detta fenomen kallades transkriptionell gentystnad
(TGS) och finns i jäst, växter och djur. siRNA styr också DNA-metylering, vilket leder till heterokromatinbildning och transkriptionell repression. TGS studeras bäst i jästen S. pombe, där siRNA visar sig vara integrerade i ett RISC-liknande proteinkomplex som kallas RITS. I hans fall, som i fallet med RISC, interagerar siRNA med ett protein från AGO-familjen. Det är troligt att siRNA kan styra detta komplex till en gen som innehåller ett homologt siRNA-fragment. Efter detta rekryterar RITS-proteiner metyltransferaser, som ett resultat av vilka heterokromatin bildas i lokuset som kodar för siRNA-målgenen, och aktivt genuttryck upphör. 
Roll i cellulära processer
Vilken betydelse har siRNA i en cell?
siRNA är involverade i cellskydd från virus, repression av transgener, reglering av vissa gener och bildning av centromerisk heterokromatin. En viktig funktion hos siRNA är undertryckande av uttrycket av mobila genetiska element. Sådan suppression kan ske både på transkriptionsnivå och posttranskriptionellt.
Genomet hos vissa virus består av DNA, medan andra består av RNA, och RNA hos virus kan vara antingen enkel- eller dubbelsträngat. Processen att skära främmande (viralt) mRNA i detta fall sker på samma sätt som beskrivits ovan, det vill säga genom att aktivera RISC-enzymkomplexet. Men för större effektivitet har växter och insekter uppfunnit ett unikt sätt att förstärka den skyddande effekten av siRNA. Genom att sammanfoga mRNA-strängen kan en sektion av siRNA, med hjälp av DICER-enzymkomplexet, först komplettera den andra strängen av mRNA och sedan klippa den på olika ställen och på så sätt skapa en mängd olika "sekundära" siRNA. De bildar i sin tur RISC och bär mRNA genom alla stadier som diskuterats ovan, tills dess fullständig destruktion. Sådana "sekundära" molekyler kommer specifikt att kunna binda inte bara till den del av det virala mRNA som den "primära" molekylen riktades till, utan också till andra områden, vilket dramatiskt ökar effektiviteten av cellulärt försvar.
I växter och lägre djurorganismer är således siRNA en viktig del av en sorts "intracellulär immunitet" som gör att de kan känna igen och snabbt förstöra främmande RNA. Om ett RNA som innehåller ett virus kommer in i cellen kommer ett sådant skyddssystem att förhindra att det förökar sig. Om viruset innehåller DNA, kommer siRNA-systemet att förhindra att det producerar virala proteiner (eftersom det nödvändiga mRNA:t för detta kommer att kännas igen och skäras), och användning av denna strategi kommer att bromsa spridningen i hela kroppen.
Däggdjur har, till skillnad från insekter och växter, ett annat försvarssystem. När främmande RNA, vars längd är mer än 30 bp, kommer in i en "mogen" (differentierad) däggdjurscell, börjar cellen att syntetisera interferon. Interferon kan, genom att binda till specifika receptorer på cellytan, stimulera en hel grupp gener i cellen. Som ett resultat syntetiseras flera typer av enzymer i cellen, som hämmar proteinsyntesen och bryter ner viralt RNA. Dessutom kan interferon också verka på närliggande, ännu inte infekterade celler, och därigenom blockera eventuell spridning av viruset.
Som du kan se är båda systemen lika på många sätt: de har ett gemensamt mål och "metoder" för arbetet. Även namnen "interferon" och "(RNA) interferens" kommer själva från en gemensam rot. Men de har också en mycket betydande skillnad: om interferon, vid de första tecknen på invasion, helt enkelt "fryser" cellens arbete och inte tillåter (för säkerhets skull) produktionen av många, inklusive "oskyldiga" proteiner i cellen, då är siRNA-systemet extremt begripligt: Varje siRNA kommer att känna igen och förstöra endast sitt eget specifika mRNA. Ersättning av bara en nukleotid i siRNA leder till en kraftig minskning av interferenseffekten . Ingen av de hittills kända genblockerarna har en sådan exceptionell specificitet för sin målgen.
Upptäckten av RNA-interferens har gett nytt hopp i kampen mot AIDS och cancer. Det är möjligt att genom att använda siRNA-terapi tillsammans med traditionell antiviral terapi kan en potentieringseffekt uppnås, där de två behandlingarna resulterar i en större terapeutisk effekt än den enkla summan av varje given separat.
För att kunna använda siRNA-interferensmekanismen i däggdjursceller måste färdiga dubbelsträngade siRNA-molekyler införas i cellerna. Den optimala storleken på sådant syntetiskt siRNA är samma 21-28 nukleotider. Om du ökar dess längd kommer cellerna att svara genom att producera interferon och minska proteinsyntesen. Syntetiska siRNA kan komma in i både infekterade och friska celler, och en minskning av proteinproduktionen i oinfekterade celler skulle vara mycket oönskad. Å andra sidan, om du försöker använda siRNA mindre än 21 nukleotider, minskar specificiteten för dess bindning till önskat mRNA och förmågan att bilda RISC-komplexet kraftigt.
Om det är möjligt att leverera siRNA på ett eller annat sätt som har förmågan att binda till någon del av HIV-genomet (som som bekant består av RNA) kan man försöka förhindra att det integreras i värdens DNA cell. Dessutom utvecklar forskare sätt att påverka olika stadier av HIV-reproduktion i en redan infekterad cell. Det senare tillvägagångssättet kommer inte att ge ett botemedel, men det kan avsevärt minska hastigheten på virusreproduktionen och ge det krökta immunsystemet en chans att "vila" från den virala attacken och försöka hantera resterna av själva sjukdomen. I figuren är de två stadierna av HIV-reproduktion i en cell, som forskarna hoppas kan blockeras med siRNA, markerade med röda kors (stadier 4-5 - integrering av viruset i kromosomen och steg 5-6 - montering av viruset och lämnar cellen). 
Idag hänför sig dock allt ovanstående endast till teoriområdet. I praktiken stöter siRNA-terapi på svårigheter som forskarna ännu inte har kunnat övervinna. Till exempel, när det gäller antiviral terapi, är det den höga specificiteten hos siRNA som kan spela ett grymt skämt: virus har som bekant förmågan att snabbt mutera, d.v.s. ändra sammansättningen av dess nukleotider. Hiv har varit särskilt framgångsrik i detta, där förändringsfrekvensen är sådan att en person som är infekterad med en subtyp av viruset efter några år kan utveckla en helt annan subtyp. I detta fall kommer den modifierade HIV-stammen automatiskt att bli okänslig för det siRNA som valdes i början av behandlingen.
Åldrande och karcinogenes
Som alla epigenetiska faktorer påverkar siRNA uttrycket av gener som tystas. Nu finns det verk som beskriver experiment med att stänga av gener förknippade med tumörer. Gener stängs av (knock-down) med siRNA. Till exempel använde kinesiska forskare siRNA för att stänga av genen för transkriptionsfaktor 4 (TCF4), vars aktivitet orsakar Pitt-Hopkins syndrom (en mycket sällsynt genetisk sjukdom som kännetecknas av mental retardation och episoder av hyperventilation och apné) och andra psykiska sjukdomar. I detta arbete studerade vi rollen av TCF4 i magcancerceller. Ektopiskt uttryck av TCF4 minskar celltillväxten i magcancercellinjer, att slå ut TCF4-genen med hjälp av siRNA ökar cellmigration. Således kan vi dra slutsatsen att epigenetisk avstängning (tystnad) av TCF4-genen spelar en viktig roll i bildandet och utvecklingen av tumörer.
Enligt forskning vid avdelningen för onkologi, Albert Einstein Cancer Center, ledd av Leonard H. Augenlicht, är siRNA involverat i att stänga av HDAC4-genen, som orsakar hämning av tjocktarmscancertillväxt, apoptos och ökad transkription av p21. HDAC4 är ett histondeacetylas som är vävnadsspecifikt, hämmar celldifferentiering och dess uttryck undertrycks under celldifferentieringsprocessen. Arbetet visar att HDAC4 är en viktig regulator av koloncellsproliferation (vilket är viktigt i cancerprocessen), och det i sin tur regleras av siRNA.
Institutionen för patologi, Nara Medical University School of Medicine i Japan forskar om prostatacancer. Replikativt åldrande av celler är en barriär mot okontrollerad delning och karcinogenes. Kortlivade delande celler (TAC) är en del av prostatacellpopulationen från vilken tumörer bildas. Japanska forskare studerade orsakerna till att dessa celler övervinner åldrandet. Prostataceller i kultur transfekterades med junB siRNA. Dessa celler uppvisar ökade uttrycksnivåer av p53, p21, p16 och pRb, som detekteras under åldrande. Celler i kultur som visade reducerade nivåer av p16 användes för nästa steg. Upprepad siRNA-transfektion till TAC tillät celler att undvika åldrande vid p16/pRb-inaktivering. Dessutom orsakar tystnad av junB-proto-onkogenen av junB siRNA cellinvasion. Baserat på detta drogs slutsatsen att junB är ett element för p16 och främjar cellulär senescens, vilket förhindrar TAC-malignitet. Således är junB en regulator av prostatacancer och kan vara ett mål för terapeutisk intervention. Och dess aktivitet kan regleras med siRNA.
Det pågår en hel del liknande studier. För närvarande är siRNA inte bara ett objekt, utan också ett verktyg i händerna på en forskare - läkare, biolog, onkolog, gerontolog. Att studera sambandet mellan siRNA och cancer och uttrycket av åldersrelaterade gener är den viktigaste uppgiften för vetenskapen. Mycket kort tid har gått sedan upptäckten av siRNA, men många intressanta studier och publikationer relaterade till dem har dykt upp. Det råder ingen tvekan om att deras studie kommer att vara ett av mänsklighetens steg mot seger över cancer och åldrande...
Artikel för tävlingen "bio/mol/text": I senaste åren RNA - och särskilt dess "icke-klassiska" sorter - drar till sig uppmärksamhet från biologer runt om i världen. Det visade sig att reglering av icke-kodande RNA är utbredd – från virus och bakterier till människor. Studiet av mångfalden av små bakteriella RNA-regulatorer har tydligt visat deras viktiga roll i både intermediär metabolism och adaptiva svar. Den här artikeln beskriver typerna av små RNA av bakterier och de reglerande mekanismer som utförs med deras hjälp. Särskild vikt läggs vid dessa molekylers roll i livet för bakteriella ämnen som orsakar särskilt farliga infektioner.
RNA: mer än bara en kopia av DNA
De flesta läsare av denna webbplats har känt till de grundläggande mekanismerna för en levande cell sedan skolan. I biologikurser, från Mendels lagar till banbrytande genomsekvenseringsprojekt, går en röd tråd genom idén om ett stort genetiskt program för utveckling av en organism, känt för professionella biologer som molekylärbiologins centrala dogm. Den anger att DNA-molekylen fungerar som en bärare och innehavare av genetisk information, som, genom en mellanhand - budbärar-RNA (mRNA), och med deltagande av ribosomalt (rRNA) och överförings-RNA (tRNA), - realiseras i form av av proteiner. De senare bestämmer arten och individuella fenotyper.
Detta tillstånd och tilldelningen av RNA till rollen som en mindre deltagare i molekylär prestanda kvarstod i det vetenskapliga samfundet fram till 80-talet av förra seklet. T. Cheks arbete, som visade att RNA kan fungera som en katalysator, tvingade oss att titta närmare på RNA kemiska reaktioner. Tidigare trodde man att accelerationen av kemiska processer i en cell är privilegiet för enzymer som uteslutande är protein i naturen. Upptäckten av katalytisk aktivitet i RNA fick långtgående konsekvenser - tillsammans med tidigare teoretiska verk K. Woese och, det tillät oss att rita en möjlig bild av prebiotisk evolution på vår planet. Faktum är att sedan upptäckten av DNA:s funktion som bärare av genetisk information, verkade dilemmat med det som dök upp tidigare under evolutionens gång - DNA eller proteinet nödvändigt för reproduktion av DNA - nästan lika filosofiskt (det vill säga meningslöst) som frågan om företräde för hönans eller äggets utseende. Efter upptäckten av T. Chek antog lösningen en mycket verklig form - en molekyl hittades som hade egenskaperna hos både en informationsbärare och en biokatalysator (om än i sin rudimentära form). Med tiden växte dessa studier till en hel riktning inom biologin, och studerade livets ursprung genom prismat av den så kallade "RNA-världen".
Så det blev uppenbart att den antika världen av RNA kunde relateras till ursprunget och blomstringen av primärliv. Det följer dock inte automatiskt av detta att RNA i moderna organismer inte är en arkaism anpassad till behoven hos intracellulära molekylära system, utan en verkligt viktig deltagare i cellens molekylära ensemble. Endast utvecklingen av molekylära metoder - i synnerhet nukleinsyrasekvensering - visade att RNA verkligen är oersättligt i cellen, och inte bara i form av den kanoniska treenigheten "mRNA, rRNA, tRNA". Redan den första omfattande informationen om DNA-sekvensering pekade på ett faktum som till en början verkade svårt att förklara - det mesta visade sig vara icke-kodning- det vill säga inte bära information om proteinmolekyler eller "standard" RNA. Naturligtvis kan detta delvis tillskrivas "genetiskt skräp" - "avstängda" eller förlorade funktionsfragment av genomet. Men att spara en sådan mängd "hemgift" för biologiska system som försöker spendera energi sparsamt verkar ologiskt.
Mer detaljerade och subtila forskningsmetoder har faktiskt gjort det möjligt att upptäcka en hel klass av RNA-regulatorer för genuttryck, som delvis fyller det intergena utrymmet. Redan innan du läste de fullständiga sekvenserna av eukaryota genom i rundmaskar C. elegans mikroRNA isolerades - små molekyler (cirka 20 nukleotider) som specifikt kan binda till regioner av mRNA enligt komplementaritetsprincipen. Det är lätt att gissa att det i sådana fall inte längre är möjligt att läsa information om de kodade proteinerna med mRNA: ribosomen kan helt enkelt inte "löpa" genom en sådan plats som plötsligt blivit dubbelsträngad. Denna mekanism för genuttrycksundertryckning kallas RNA-interferens, har redan analyserats på "biomolekylen" tillräckligt detaljerat. Hittills har tusentals mikroRNA-molekyler och andra icke-kodande RNA (piRNA, snoRNA, nanoRNA, etc.) upptäckts. Hos eukaryoter (inklusive människor) finns de i intergena regioner. Deras viktiga roll i celldifferentiering, karcinogenes, immunsvar och andra processer och patologier har fastställts.
Små RNA är en trojansk häst för bakterieproteiner
Trots det faktum att icke-proteinkodande RNA i bakterier upptäcktes mycket tidigare än de första liknande regulatorerna i eukaryoter, deras roll i metabolismen av bakteriecellen på länge var beslöjad för det vetenskapliga samfundet. Detta är förståeligt - traditionellt sett ansågs bakteriecellen vara en mer primitiv och mindre mystisk struktur för forskaren, vars komplexitet inte kan jämföras med ackumuleringen av strukturer i en eukaryot cell. Dessutom är innehållet av icke-kodande information i bakteriegenom bara några få procent av total längd DNA, som når maximalt 40 % i vissa mykobakterier. Men med tanke på att mikroRNA finns även i virus, bör de i bakterier spela en viktig reglerande roll, ännu mer.
Det visade sig att prokaryoter har ganska många små RNA-regulatorer. Konventionellt kan alla delas in i två grupper:
- RNA-molekyler som måste binda till proteiner för att utföra sin funktion.
- RNA som binder komplementärt till andra RNA (innefattar majoriteten av kända RNA-regulatoriska molekyler).
Den första gruppen inkluderar små RNA för vilka proteinbindning är möjlig men inte nödvändig. Ett välkänt exempel är RNase P, som fungerar som ett ribozym på "mognad" tRNA. Men om RNas P kan fungera utan en proteinkomponent, är bindning till protein obligatoriskt för andra små RNA i denna grupp (och de själva är i själva verket kofaktorer). Till exempel aktiverar tmRNA ett komplext proteinkomplex, som fungerar som en "huvudnyckel" för en "fast" ribosom - om budbärar-RNA:t från vilket det läses har nått sitt slut och stoppkodonet inte har påträffats.
En ännu mer spännande mekanism för direkt interaktion av små RNA med proteiner är också känd. Proteiner som binder till "traditionella" nukleinsyror är brett spridda i alla celler. Den prokaryota cellen är inget undantag. Till exempel hjälper dess histonliknande proteiner till att korrekt packa DNA-strängen, och specifika repressorproteiner har en affinitet för operatörsregionen av bakteriella gener. Det har visat sig att dessa repressorer kan hämmas av små RNA som imiterar DNA-bindningsställen "native" för dessa proteiner. På det lilla RNA CsrB (Fig. 1) finns det alltså 18 "lock"-ställen som tjänar till att förhindra CsrA-repressorproteinet från att nå sitt verkliga mål - glykogenoperonet. Förresten, bland de repressorproteiner som går vilse på grund av så små RNA, finns det regulatorer av globala metaboliska vägar, vilket gör det möjligt att upprepade gånger förbättra den hämmande signalen för litet RNA. Till exempel gör den detta litet RNA 6S, "imiterar" proteinfaktorn σ 70. Genom konfigurationsmässigt "bedrägeri", som ockuperar bindningscentrumen för RNA-polymeras med sigmafaktorn, förbjuder det uttrycket av "hushållnings"-gener.
Figur 1. Bioinformatiskt förutsagd sekundär struktur av det lilla RNA CsrB från Vibrio cholerae M66-2. Små RNA är enkelsträngade molekyler, men som för andra RNA åtföljs veckning till en stabil rumslig struktur av bildandet av områden där molekylen hybridiserar till sig själv. Många böjar på strukturen i form av öppna ringar kallas stilettklackar. I vissa fall tillåter en kombination av hårnålar RNA:t att fungera som en "svamp", som icke-kovalent binder vissa proteiner. Men oftare stör molekyler av denna typ DNA eller RNA; i detta fall störs den rumsliga strukturen av det lilla RNA:t och nya ställen för hybridisering med målmolekylen bildas. Värmekartan återspeglar sannolikheten att motsvarande nukleotidpar faktiskt kommer att vara länkat med en intramolekylär vätebindning; för oparade sektioner - sannolikheten för att bilda vätebindningar med alla sektioner inuti molekylen. Bilden togs med hjälp av programmet RNAfold.
Små RNA av bakterier stör... och mycket framgångsrikt!
Mekanismen genom vilken regulatorer i den andra gruppen fungerar liknar i allmänhet den för regulatoriska RNA i eukaryoter - detta är samma RNA-interferens genom hybridisering med mRNA, bara kedjorna av små RNA själva är ofta längre - upp till flera hundra nukleotider ( cm. ris. 1). Som ett resultat, på grund av litet RNA, kan ribosomer inte läsa information från mRNA. Även om det ofta verkar som om det inte kommer till detta: de resulterande "små RNA - mRNA"-komplexen blir målet för RNaser (som RNas P).
Kompaktheten och packningsdensiteten hos det prokaryota genomet gör sig påmind: om i eukaryoter de flesta regulatoriska RNA:n skrivs i separata (oftast inte proteinkodande) loci, så kan många små RNA av bakterier kodas i samma DNA-region som de undertryckta. gen, men på motsatta kedjor! Dessa RNA kallas cis-kodad(antisens), och små RNA som ligger på ett visst avstånd från den undertryckta delen av DNA - transkodad. Uppenbarligen kan arrangemanget av cis-RNA betraktas som en triumf av ergonomin: de kan avläsas från den motsatta DNA-strängen i ögonblicket av dess avveckling samtidigt med måltranskriptet, vilket gör det möjligt att finkontrollera mängden syntetiserat protein.
Små RNA i trans utvecklas oberoende av mål-mRNA, och regulatorns sekvens förändras kraftigare som ett resultat av mutationer. Kanske är denna situation bara fördelaktig för bakteriecellen, eftersom små RNA förvärvar aktivitet mot tidigare ovanliga mål, vilket minskar tids- och energikostnaderna för att skapa andra regulatorer. Å andra sidan förhindrar selektionstryck trans-liten RNA från att mutera för mycket eftersom det kommer att förlora aktivitet. Men för att hybridisera med budbärar-RNA kräver de flesta trans-små RNA:er en hjälpare, Hfq-proteinet. Tydligen, annars kan ofullständig komplementaritet av det lilla RNA:t skapa problem för att binda till målet.
Tydligen hjälper en potentiell regleringsmekanism baserad på principen om "ett litet RNA - många mål" till att integrera bakteriens metaboliska nätverk, vilket är extremt nödvändigt under förhållanden med kort encellsliv. Man kan fortsätta spekulera i ämnet och anta att med hjälp av transkodade små RNA:n skickas uttrycks-"instruktioner" från funktionellt relaterade, men fysiskt avlägsna loci. Behovet av denna typ av genetiska "upprop" förklaras logiskt stort antal små RNA som finns i patogena bakterier. Till exempel hittades flera hundra små RNA i rekordhållaren för denna indikator - Vibrio cholerae ( Vibrio cholerae). Detta är en mikroorganism som kan överleva i miljön vattenmiljö(både färskt och salt), och i vattenlevande blötdjur, och i fisk och i mänskliga tarmar - här kan du inte klara dig utan komplex anpassning med hjälp av reglerande molekyler!
CRISPR skyddar bakteriens hälsa
Små RNA har också använts för att lösa ett annat akut problem för bakterier. Även de mest illvilliga patogena kockerna och bacillerna kan vara maktlösa inför faran från speciella virus - bakteriofager, som kan förstöra bakteriepopulationen blixtsnabbt. Flercelliga organismer har ett specialiserat system för skydd mot virus - immun, med hjälp av celler och de ämnen de utsöndrar, skyddar kroppen från objudna gäster (inklusive de av viral natur). En bakteriecell är en ensamvarg, men den är inte så sårbar som den kan verka vid första anblicken. Loci fungerar som väktare av recepten för att upprätthålla den antivirala immuniteten hos bakterier CRISPR- klustrade regelbundna avbrutna korta palindromiska upprepningar ( klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar) (Fig. 2; ). I prokaryota genom representeras varje CRISPR-kassett av en ledarsekvens flera hundra nukleotider lång, följt av en serie på 2–24 (ibland upp till 400) upprepningar separerade av spacerregioner som är lika i längd men unika i nukleotidsekvens. Längden på varje distans och upprepning överstiger inte hundra baspar.
Figur 2. CRISPR-lokus och bearbetning av dess motsvarande lilla RNA till ett funktionellt transkript. I genomet CRISPR- kassetten representeras av distansbrickor varvade med varandra (i figuren är de betecknade som Sp), delvis homolog med regioner av fag-DNA, och upprepar ( Av) 24–48 bp lång, visar dyadisk symmetri. Till skillnad från upprepningar är spacers inom samma lokus lika långa (i olika bakterier kan detta vara 20–70 nukleotider), men skiljer sig i nukleotidsekvens. Sektionerna "spacer-repeat" kan vara ganska långa och bestå av flera hundra enheter. Hela strukturen flankeras på ena sidan av en ledarsekvens ( LP, flera hundra baspar). Cas-gener finns i närheten ( C RISPR-som associerad), organiserad i en operon. Proteiner som läses från dem utför ett antal hjälpfunktioner, vilket ger bearbetning av transkriptet som läses från CRISPR-locus, dess framgångsrika hybridisering med fag-DNA-målet, införande av nya element i lokuset, etc. CrRNA som bildas som ett resultat av flerstegsbearbetning hybridiserar med en del av DNA (nedre delen av figuren) som injiceras av fagen i bakterien. Detta tystar transkriptionsmaskinen för viruset och stoppar dess reproduktion i den prokaryota cellen.
Detaljerad mekanism för uppkomsten av allt CRISPR-lokus återstår att studera. Men idag har ett schematiskt diagram över utseendet på distanser, de viktigaste strukturerna i dess sammansättning, föreslagits. Det visar sig att "bakteriejägarna" blir slagna av sina egna vapen - nukleinsyror, eller snarare "trofé" genetisk information som tagits emot av bakterier från fager i tidigare strider! Faktum är att inte alla fager som kommer in i en bakteriecell är dödliga. DNA från sådana fager (möjligen klassificerade som tempererade) skärs av speciella Cas-proteiner (deras gener flankerar CRISPR) i små fragment. Några av dessa fragment kommer att bäddas in i CRISPR- loci av "värdgenomet". Och när fag-DNA:et kommer in i bakteriecellen igen, stöter det på litet RNA från CRISPR-locus, i det ögonblicket uttryckt och bearbetat av Cas-proteiner. Efter detta sker inaktivering av den virala genetiska informationen enligt mekanismen för RNA-interferens som redan beskrivits ovan.
Från hypotesen om bildandet av spacers är det inte klart varför upprepningar behövs mellan dem, inom ett lokus som är något annorlunda i längd, men nästan identiskt i sekvens? Här finns ett stort utrymme för fantasi. Kanske, utan upprepningar, skulle det vara problematiskt att dela upp genetisk data i semantiska fragment, liknande sektorer på en dators hårddisk, och sedan komma åt transkriptionsmaskinen till strikt definierade områden CRISPR- skulle det bli svårt? Eller kanske upprepningar förenklar rekombinationsprocesser när nya element av fag-DNA sätts in? Eller är det "skiljetecken" som är oumbärliga för CRISPR-bearbetning? Hur som helst, en biologisk orsak som förklarar beteendet hos en bakteriecell på samma sätt som Gogols Plyushkin kommer att hittas i sinom tid.
CRISPR, som är en "krönika" av förhållandet mellan en bakterie och en fag, kan användas i fylogenetiska studier. Sålunda nyligen utförd maskinskrivning enl CRISPR tillät oss att titta på utvecklingen av enskilda stammar av pestmikroben ( Yersinia pestis). Undersök dem CRISPR- "stamtavlor" kastar ljus över händelser för ett halvt årtusende sedan, när stammar kom in i Mongoliet från det som nu är Kina. Men denna metod är inte tillämplig för alla bakterier, och i synnerhet patogener. Trots nya bevis på förutspådda CRISPR-bearbetningsproteiner i tularemipatogener ( Francisella tularensis) och kolera, CRISPR själva, om de finns i deras genom, är få till antalet. Kanske är fager, med tanke på deras positiva bidrag till förvärvet av virulens av patogena representanter för bakterieriket, inte så skadliga och farliga att försvara mot dem med CRISPR? Eller är virusen som attackerar dessa bakterier för olika, och strategin att "störa" RNA-immunitet mot dem är meningslös?
Figur 3. Några mekanismer för riboswitchdrift. Riboswitchar (riboswitchar) är inbyggda i budbärar-RNA:t, men kännetecknas av stor frihet för konformationsbeteende, beroende på specifika ligander, vilket ger anledning att betrakta riboswitchar som oberoende enheter av små RNA. En förändring i konformationen av uttrycksplattformen påverkar platsen för ribosomlandning på mRNA ( RBS), och, som en konsekvens, bestämmer tillgängligheten av allt mRNA för läsning. Riboswitchar liknar till viss del operatörsdomänen i den klassiska modellen lac-operon - men endast aptamerregioner regleras vanligtvis av lågmolekylära substanser och switchar gendrift på nivån av mRNA, inte DNA. A - I frånvaro av ligander, riboswitchar btuB (kobalamintransportör) Och thiM (tiaminpyrofosfatberoende), som utför icke-nukleolytisk repression av mRNA, är "påslagna" ( PÅ) och tillåta ribosomen att utföra sin verksamhet. Bindning av ligand till riboswitch ( AV-position) leder till bildandet av en hårnål, vilket gör denna region otillgänglig för ribosomen. b - Lysin riboswitch lysC i frånvaro av en ligand ingår också ( PÅ). Att stänga av riboswitchen blockerar ribosomen från att komma åt mRNA. Men till skillnad från riboswitcharna som beskrivs ovan, i lysinomkopplaren, när den är avstängd, "exponeras en sektion", skärs av ett speciellt RNase-komplex ( degradosom), och allt mRNA används och bryts ner till små fragment. Förtryckning av riboswitchen i detta fall kallas nukleolytisk ( nukleolytisk) och är irreversibel, eftersom, till skillnad från exemplet ( A ), bakåtväxling (tillbaka till PÅ) är inte längre möjligt. Det är viktigt att notera att på detta sätt kan utnyttjandet av en grupp "onödiga" mRNA:n uppnås: en riboswitch liknar en del av en barnkonstruktion, och en hel grupp av funktionellt besläktade matrismolekyler kan ha omkopplare liknande i strukturera.
Riboswitch - sensor för bakterier
Så det finns proteinassocierande små RNA, det finns små RNA som stör bakteriernas eget mRNA, och även RNA som fångas upp av bakterier från virus och undertrycker fag-DNA. Är det möjligt att föreställa sig någon annan regleringsmekanism med hjälp av små RNA? Det visar sig ja. Om vi analyserar det som beskrevs ovan kommer vi att finna att i alla fall av antisense-reglering observeras interferens av litet RNA och målet som ett resultat av hybridisering av två enskild molekyler. Varför inte ordna litet RNA som en del av själva utskriften? Sedan är det möjligt att, genom att ändra konformationen av en sådan "felplacerad kosack" inuti mRNA:t, ändra tillgängligheten för hela mallen för läsning under translation eller, vilket är ännu mer energiskt ändamålsenligt, att reglera biosyntesen av mRNA, d.v.s. transkription!
Sådana strukturer är allmänt närvarande i bakterieceller och är kända som riboswitchar ( riboswitch). De är belägna före början av den kodande delen av genen, vid 5′-änden av mRNA. Konventionellt kan två strukturella motiv urskiljas i sammansättningen av riboswitchar: aptamer-regionen, ansvarig för bindning till liganden (effektor), och uttrycksplattform tillhandahåller reglering av genuttryck genom övergången av mRNA till alternativa rumsliga strukturer. Till exempel används en sådan omkopplare ("av"-typ) för att fungera lysinoperon: när det finns ett överskott av lysin, existerar det i form av en "trasslig" rumslig struktur som blockerar läsning från operonet, och när det är brist på det, "lindas" riboswitchen och de proteiner som är nödvändiga för biosyntesen av lysin syntetiseras (fig. 3).
Det beskrivna schemat för riboswitchanordningen är inte kanon, det finns variationer. En nyfiken "slå-på" tandem riboswitch upptäcktes i Vibrio cholerae: uttrycksplattformen föregås av två på en gång aptamer-regionen. Uppenbarligen ger detta större känslighet och ett jämnare svar på uppkomsten av en annan aminosyra i cellen - glycin. Kanske är en "dubbel" riboswitch i genomet av mjältbrandspatogenen, liknande i principen om verkan, indirekt involverad i den höga överlevnadsgraden för bakterien ( Bacillus anthracis). Det reagerar på en förening som är en del av det minimala mediet och är avgörande för denna mikrobe - tiaminpyrofosfat.
Förutom att byta metabola vägar beroende på "menyn" som är tillgänglig för bakteriecellen, kan riboswitchar vara sensorer för bakteriell homeostas. Således märktes de i regleringen av tillgängligheten av en gen för läsning när funktionen av translationssystemet inuti cellen störs (till exempel signaler som uppkomsten av "oladdade" tRNA och "felaktiga" (stoppade) ribosomer ), eller när miljöfaktorer förändras (till exempel en ökning av temperaturen).
Inget behov av proteiner, ge oss RNA!
Så vad betyder närvaron av en sådan mångfald av små RNA-regulatorer inuti bakterier? Indikerar detta ett övergivande av konceptet där proteiner är de främsta "förvaltarna", eller ser vi en annan modetrend? Tydligen varken det ena eller det andra. Naturligtvis är vissa små RNA globala regulatorer av metabola vägar, såsom det nämnda CsrB, som tillsammans med CsrC är involverat i regleringen av lagring av organiskt kol. Men med tanke på principen om duplicering av funktioner i biologiska system, kan bakteriella små RNA:n jämföras med en "krischef" snarare än en VD. Således, under förhållanden där det är nödvändigt för en mikroorganisms överlevnad snabb omkonfigurera intracellulär metabolism, kan deras reglerande roll vara avgörande och effektivare än för proteiner med liknande funktioner. Således är RNA-regulatorer snarare ansvariga för ett snabbt svar, mindre stabilt och pålitligt än i fallet med proteiner: vi bör inte glömma att små RNA bibehåller sin 3D-struktur och hålls på den hämmade matrisen av svaga vätebindningar.
Indirekt bekräftelse av dessa teser kan vara de redan nämnda små RNA från Vibrio cholerae. För denna bakterie är det inte ett önskat mål att komma in i människokroppen, utan tydligen en nödsituation. Produktionen av toxiner och aktivering av andra vägar förknippade med virulens i detta fall är bara en defensiv reaktion på det aggressiva motståndet från miljön och kroppscellerna mot "främlingar". "Frälsarna" här är små RNA - till exempel Qrr, som hjälper vibrio, under stressiga förhållanden, att ändra sin överlevnadsstrategi och ändra kollektivt beteende. Denna hypotes kan också indirekt bekräftas av upptäckten av det lilla RNA:t VrrA, som aktivt syntetiseras när vibrios finns i kroppen och undertrycker produktionen av membranproteiner Omp. "Gömda" membranproteiner i den inledande fasen av infektion kan hjälpa till att undvika ett kraftfullt immunsvar från människokroppen (Fig. 4).
Figur 4. Små RNA i implementeringen av de patogena egenskaperna hos Vibrio cholerae. A – Vibrio cholerae mår bra och förökar sig bra i vattenmiljön. Människokroppen är förmodligen inte den huvudsakliga ekologiska nischen för denna mikrob. b - Väl genom vattnet eller matvägen för överföring av infektion till en aggressiv miljö - den mänskliga tunntarmen - börjar vibrios, i termer av organiserat beteende, att likna en pseudoorganism, vars huvuduppgift är att begränsa immunsvaret och skapa en gynnsam miljö för kolonisering. Membranvesiklar är av stor betydelse för att koordinera handlingar inom en bakteriepopulation och deras interaktion med kroppen. Ej helt förstådda miljöfaktorer i tarmen fungerar som signaler för uttryck av små RNA (till exempel VrrA) i vibrios. Som ett resultat utlöses mekanismen för bildandet av vesiklar, som är icke-immunogena när antalet Vibrio-celler i tarmen är lågt. Utöver den beskrivna effekten hjälper små RNA till att "dölja" Omp-membranproteiner som är potentiellt provocerande för det mänskliga immunsystemet. Med indirekt deltagande av små RNA Qrr1-4 utlöses intensiv produktion av koleratoxin (visas inte i figuren), vilket kompletterar utbudet av adaptiva reaktioner av Vibrio cholerae. V - Inom några timmar mängden bakteriecellerökar, och poolen av små VrrA-RNA minskar, vilket sannolikt leder till exponering av membranproteiner. Antalet "tomma" vesiklar minskar också gradvis, och i detta skede ersätts de av immunogena som levereras till enterocyter. Tydligen är detta en del av "planen" för att implementera en komplex signal, vars innebörd är att provocera evakueringen av vibrios från människokroppen. OBS: storleksförhållandet mellan bakterieceller och enterocyter observeras inte.
Det ska bli intressant att se hur vår förståelse av små RNA-regulatorer kommer att förändras när nya data erhålls på RNAseq-plattformar, inklusive på frilevande och oodlade former. Nyligen arbete med "djup sekvensering" har redan gett oväntade resultat, vilket indikerar närvaron av mikroRNA-liknande molekyler i mutanta streptokocker. Naturligtvis behöver sådana data noggrann dubbelkontroll, men hur som helst kan vi med säkerhet säga att studiet av små RNA i bakterier kommer att ge många överraskningar.
Erkännanden
De ursprungliga idéerna och kompositionsdesignen när du skapar titelbilden, såväl som bild 4, tillhör en examen från Institute of Archiology vid Southern Federal University Kopaeva E.A. Närvaron av figur 2 i artikeln är docentens förtjänst. Zoologi SFU G.B. Bakhtadze. Han genomförde också vetenskaplig korrekturläsning och revidering av titelfiguren och figur 4. Författaren uttrycker sin djupa tacksamhet till dem för deras tålamod och kreativa inställning till saken. Ett särskilt tack till min kollega, senior forskare. labb. biokemi av mikrober från Rostov Anti-Plague Institute Sorokin V.M. för att diskutera texten i artikeln och göra värdefulla kommentarer.
Litteratur
- Carl Woese (1928–2012) ;;. 80 , 1148-1154;
- R. R. Brytare. (2012). Riboswitchar och RNA-världen. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 , a003566-a003566;
- J. Patrick Bardill, Brian K. Hammer. (2012). Icke-kodande sRNA reglerar virulens i den bakteriella patogenen Vibrio cholerae. RNA-biologi. 9 , 392-401;
- Heon-Jin Lee, Su-Hyung Hong. (2012). Analys av små RNA i mikroRNA-storlek i Streptococcus mutans genom djup sekvensering. FEMS Microbiol Lett. 326 , 131-136;
- M.-P. Caron, L. Bastet, A. Lussier, M. Simoneau-Roy, E. Masse, D. A. Lafontaine. (2012). Dubbelverkande riboswitchkontroll av translationsinitiering och mRNA-sönderfall. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 , E3444-E3453.
), förhindrar translationen av mRNA på ribosomer till proteinet det kodar för. I slutändan är effekten av litet störande RNA identisk med effekten av att helt enkelt reducera genuttryck.
Små störande RNA upptäcktes 1999 av David Baulcombes grupp i Storbritannien som en del av ett post-transkriptionellt gentystnadssystem i växter. PTGS, sv: post-transkriptionell gentystnad). Teamet publicerade sina resultat i tidskriften Science.
Dubbelsträngat RNA kan förbättra genuttrycket genom en mekanism som kallas RNA-beroende genaktivering. RNAa, liten RNA-inducerad genaktivering). Det har visats att dubbelsträngade RNA som är komplementära till promotorerna för målgener orsakar aktivering av motsvarande gener. RNA-beroende aktivering vid administrering av syntetiskt dubbelsträngat RNA har visats för humana celler. Det är inte känt om ett liknande system finns i andra organismers celler.
Genom att tillhandahålla förmågan att stänga av i princip vilken gen som helst efter behag, har små störande RNA-baserade RNA-interferenser genererat ett enormt intresse för grundläggande och tillämpad biologi. Antalet brett baserade RNAi-baserade tester för att identifiera viktiga gener i biokemiska vägar växer. Eftersom utvecklingen av sjukdomar också bestäms av geners aktivitet förväntas det i vissa fall att stänga av en gen med hjälp av litet störande RNA kan ha en terapeutisk effekt.
Tillämpningen av små störande RNA-baserade RNA-interferenser på djur, och särskilt på människor, möter dock många svårigheter. Experiment har visat att effektiviteten av små störande RNA är olika för olika typer celler: vissa celler reagerar lätt på påverkan av litet störande RNA och uppvisar en minskning av genuttryck, medan detta i andra inte observeras, trots effektiv transfektion. Orsakerna till detta fenomen är fortfarande dåligt förstådda.
Resultat från fas 1-studier av de två första RNAi-läkemedlen (avsedda att behandla makuladegeneration), publicerade i slutet av 2005, visar att små störande RNA-läkemedel lätt tolereras av patienter och har acceptabla farmakokinetiska egenskaper.
Preliminära kliniska prövningar av små störande RNA som riktar sig mot ebolaviruset indikerar att de kan vara effektiva för profylax efter exponering av sjukdomen. Detta läkemedel gjorde det möjligt för hela gruppen experimentella primater att överleva efter att ha fått en dödlig dos av Zaire Ebolavirus
Destruktion av mål-mRNA:t kan också ske under påverkan av litet störande RNA (siRNA). RNA-interferens är en av de nya revolutionerande upptäckterna inom molekylärbiologi, och dess författare fick en Nobelpriset. Störande RNA skiljer sig mycket i struktur från andra typer av RNA och är två komplementära RNA-molekyler som är ungefär 21-28 kvävebaser långa, som är förbundna med varandra som strängar i en DNA-molekyl. I detta fall förblir alltid två oparade nukleotider vid kanterna av varje siRNA-kedja. Påverkan utförs enligt följande. När en siRNA-molekyl befinner sig i en cell, binder den i det första skedet till ett komplex med två intracellulära enzymer - helikas och nukleas. Detta komplex kallades RISC ( R NA- i inducerad s dämpning c komplex; tystnad - engelska vara tyst, håll käften; tysta - tysta, det är så processen att "stänga av" en gen kallas i engelska och specialiserad litteratur). Därefter lindar helikaset upp och separerar siRNA-strängarna, och en av strängarna (antisens i strukturen) i komplex med nukleaset interagerar specifikt med den komplementära (som strikt motsvarar det) regionen av mål-mRNA, vilket gör att nukleaset kan skära det. i två delar. De skurna sektionerna av mRNA exponeras sedan för verkan av andra cellulära RNA-nukleaser, som ytterligare skär dem i mindre bitar.
SiRNA som finns i växter och lägre djurorganismer (insekter) är en viktig del av en sorts "intracellulär immunitet" som gör att de kan känna igen och snabbt förstöra främmande RNA. Om ett RNA som innehåller ett virus kommer in i cellen kommer ett sådant skyddssystem att förhindra att det förökar sig. Om viruset innehåller DNA, kommer siRNA-systemet att förhindra att det producerar virala proteiner (eftersom det nödvändiga mRNA:t för detta kommer att kännas igen och skäras), och användning av denna strategi kommer att bromsa spridningen i hela kroppen. Det har fastställts att siRNA-systemet är extremt diskriminerande: varje siRNA kommer att känna igen och förstöra endast sitt eget specifika mRNA. Ersättning av bara en nukleotid i siRNA leder till en kraftig minskning av interferenseffekten. Ingen av de hittills kända genblockerarna har en sådan exceptionell specificitet för sin målgen.
För närvarande används denna metod främst i vetenskaplig forskning att identifiera funktionerna hos olika cellulära proteiner. Det kan dock potentiellt också användas för att skapa mediciner.
Upptäckten av RNA-interferens har gett nytt hopp i kampen mot AIDS och cancer. Det är möjligt att genom att använda siRNA-terapi i kombination med traditionella antivirala och anticancerterapier kan en potentieringseffekt uppnås, där de två behandlingarna resulterar i en större terapeutisk effekt än den enkla summan av var och en som ges ensam.
För att kunna använda siRNA-interferensmekanismen i däggdjursceller för terapeutiska ändamål måste färdiga dubbelsträngade siRNA-molekyler införas i cellerna. Det finns dock ett antal problem som för närvarande inte tillåter detta att göras i praktiken, än mindre att skapa några doseringsformer. För det första, i blodet påverkas de av den första delen av kroppens försvar, enzymer - nukleaser, som skär potentiellt farliga och ovanliga dubbelsträngar av RNA för vår kropp. För det andra, trots deras namn, är små RNA fortfarande ganska långa, och viktigast av allt, de bär på en negativ elektrostatisk laddning, vilket gör deras passiva penetration in i cellen omöjlig. Och för det tredje är en av de viktigaste frågorna hur man får siRNA att fungera (eller penetrera) bara i vissa (”sjuka”) celler, utan att påverka friska? Och till sist är det frågan om storlek. Den optimala storleken på sådant syntetiskt siRNA är samma 21-28 nukleotider. Om du ökar dess längd kommer cellerna att svara genom att producera interferon och minska proteinsyntesen. Å andra sidan, om du försöker använda siRNA mindre än 21 nukleotider, minskar specificiteten för dess bindning till önskat mRNA och förmågan att bilda RISC-komplexet kraftigt. Det bör noteras att att övervinna dessa problem är avgörande inte bara för siRNA-terapi, utan också för genterapi i allmänhet.
Vissa framsteg har redan gjorts för att lösa dem. Till exempel försöker forskare kemiska modifieringar göra siRNA-molekyler fler lipofila, det vill säga kan lösas upp i fetterna som utgör cellmembranet och på så sätt underlätta penetreringen av siRNA i cellen. Och för att säkerställa specificiteten för arbetet endast inom vissa vävnader, inkluderar genetiska ingenjörer i sina konstruktioner speciella regulatoriska avsnitt, som aktiveras och utlöser läsningen av informationen som finns i en sådan konstruktion (och därför siRNA, om den ingår där), endast i vissa celltyger.
Så forskare från University of California, San Diego School of Medicine har utvecklat ett nytt effektivt system för att leverera små störande RNA (siRNA), som undertrycker produktionen av vissa proteiner, till celler. Detta system bör bli grunden för teknik för specifik leverans av läkemedel till olika typer cancertumörer. "Små störande RNA, som utför en process som kallas RNA-interferens, har en otrolig potential för att behandla cancer," förklarar professor Steven Dowdy, som ledde forskningen: "och även om vi fortfarande har mycket arbete att göra, just nu"Vi har utvecklat en teknologi för att leverera läkemedel till en population av celler - både den primära tumören och metastaser, utan att skada friska celler."
I många år har Dowdy och hans kollegor studerat anticancerpotentialen hos små störande RNA. Konventionella siRNA är dock små, negativt laddade molekyler som på grund av sina egenskaper är extremt svåra att leverera till celler. För att uppnå detta använde forskare ett kort signalprotein PTD (peptidtransduktionsdomän). Tidigare skapades mer än 50 "hybridproteiner" med dess användning, där PTD kombinerades med tumörsuppressorproteiner.
Att bara koppla siRNA till PTD leder dock inte till leverans av RNA in i cellen: siRNA är negativt laddat, PTD är positivt laddat, vilket resulterar i bildandet av ett tätt RNA-proteinkonglomerat som inte transporteras över cellmembranet. Så forskarna kopplade först PTD till en protein-RNA-bindande domän som neutraliserade den negativa laddningen av siRNA (vilket resulterade i ett fusionsprotein som kallas PTD-DRBD). Ett sådant RNA-proteinkomplex passerar lätt genom cellmembranet och går in i cellcytoplasman, där det specifikt hämmar budbärar-RNA-proteinerna som aktiverar tumörtillväxt.
För att bestämma förmågan hos PTD-DRBD-fusionsproteinet att leverera siRNA till celler, använde forskarna en cellinje som härrörde från mänsklig lungcancer. Efter behandling av celler med PTD-DRBD-siRNA fann man att tumörceller var mest mottagliga för siRNA, medan det i normala celler (T-celler, endotelceller och embryonala stamceller användes som kontroller), där det inte fanns någon ökad produktion av onkogena proteiner observerades inga toxiska effekter.
Denna metod kan utsättas för olika modifieringar med hjälp av olika siRNA för att undertrycka olika tumörproteiner - inte bara de som produceras i överskott, utan även mutanta. Det är också möjligt att modifiera behandlingen vid återfall av tumörer, som vanligtvis blir resistenta mot cytostatika på grund av nya mutationer.
Onkologiska sjukdomar är mycket varierande och de molekylära egenskaperna hos tumörcellsproteiner är individuella för varje patient. Författarna till arbetet tror att i denna situation är användningen av små störande RNA det mest rationella tillvägagångssättet för terapi.
Forskare tror att feluttryck av små RNA är en av orsakerna till ett antal sjukdomar som allvarligt påverkar hälsan hos många människor runt om i världen. Dessa sjukdomar inkluderar kardiovaskulär 23 och cancer 24 . När det gäller det senare är detta inte förvånande: cancer indikerar anomalier i utvecklingen av celler och deras öde, och små RNA spelar avgörande roll i relevanta processer. Här är en av de mycket belysande exempel den enorma påverkan som små RNA har på kroppen under cancer. Det handlar om om en elakartad tumör, som kännetecknas av felaktigt uttryck av de gener som verkar under den initiala utvecklingen av organismen, och inte i den postnatala perioden. Detta är en typ av hjärntumör i barndomen som vanligtvis uppträder före två års ålder. Tyvärr är detta en mycket aggressiv cancerform, och prognosen här är ogynnsam även vid intensiv behandling. Den onkologiska processen utvecklas på grund av felaktig omfördelning genetiskt material i hjärnceller. En promotor som normalt driver starkt uttryck av en av de proteinkodande generna genomgår rekombination med ett specifikt kluster av små RNA. Sedan genomgår hela denna omarrangerade region amplifiering: med andra ord skapas många kopior av den i genomet. Följaktligen uttrycks små RNA belägna "nedströms" om den flyttade promotorn mycket starkare än de borde vara. Nivån av aktiva små RNA är ungefär 150-1000 gånger högre än normalt.
Ris. 18.3. Små RNA aktiverade av alkohol kan kombineras med budbärar-RNA som inte påverkar kroppens motståndskraft mot alkoholens effekter. Men dessa små RNA binder inte till budbärar-RNA-molekylerna som främjar sådan resistens. Detta resulterar i en relativ dominans av andelen budbärar-RNA-molekyler som kodar för proteinvariationer associerade med alkoholtolerans.
Detta kluster kodar för mer än 40 olika små RNA. I själva verket är detta i allmänhet den största av sådana kluster som finns hos primater. Det uttrycks vanligtvis först i ett tidigt skede mänsklig utveckling, under de första 8 veckorna av embryonalt liv. Dess starka aktivering i spädbarnshjärnan leder till katastrofala effekter på genetiskt uttryck. En konsekvens är uttrycket av ett epigenetiskt protein som lägger till modifieringar av DNA:t. Detta leder till omfattande förändringar i hela mönstret för DNA-metylering och därför till onormalt uttryck av alla möjliga gener, av vilka många endast bör uttryckas när omogna hjärnceller delar sig under de tidiga utvecklingsstadierna av organismen. Så här startar cancerprogrammet i barnets celler 25.
Sådan kommunikation mellan små RNA och cellens epigenetiska maskineri kan ha en betydande inverkan på andra situationer när celler utvecklar en predisposition för cancer. Denna mekanism resulterar sannolikt i att effekten av störningar av små RNA-uttryck förstärks av förändringar i epigenetiska modifieringar som överförs till dotterceller från modern. Detta kan skapa ett mönster av potentiellt farliga förändringar i mönstret för genuttryck.
Hittills har forskare inte räknat ut alla stadier av interaktionen av små RNA med epigenetiska processer, men de kan fortfarande få några tips om funktionerna i vad som händer. Till exempel visade det sig att en viss klass av små RNA, som ökar aggressiviteten hos bröstcancer, riktar sig mot vissa enzymer i budbärar-RNA som tar bort viktiga epigenetiska modifieringar. Detta förändrar mönstret av epigenetiska modifieringar i cancercellen och stör ytterligare genetiskt uttryck 26 .
Många cancerformer är svåra att spåra hos en patient. Onkologiska processer kan förekomma på svåråtkomliga platser, vilket komplicerar provtagningsproceduren. I sådana fall är det inte lätt för läkaren att övervaka utvecklingen av cancerprocessen och svaret på behandlingen. Ofta tvingas läkare att förlita sig på indirekta mätningar - säg en tomografisk skanning av en tumör. Vissa forskare tror att små RNA-molekyler kan bidra till att skapa en ny teknik för att övervaka tumörutveckling, som också kan studera dess ursprung. När cancerceller dör lämnar små RNA cellen när den spricker. Dessa små skräpmolekyler bildar ofta komplex med cellulära proteiner eller är inslagna i fragment cellmembran. På grund av detta är de mycket stabila i kroppsvätskor, vilket gör att sådana RNA kan isoleras och analyseras. Eftersom deras kvantiteter är små kommer forskarna att behöva använda mycket känsliga analysmetoder. Men ingenting är omöjligt här: känsligheten för nukleinsyrasekvensering ökar ständigt 27 . Data har publicerats som bekräftar löftet om detta tillvägagångssätt för bröstcancer 28 , äggstockscancer 29 och ett antal andra cancerformer. Analys av små cirkulerande RNA hos lungcancerpatienter har visat att dessa RNA hjälper till att skilja mellan patienter med en ensam lungknöl (som inte kräver behandling) och patienter som utvecklar maligna tumörknölar (kräver behandling) 30 .
