De ingår inte i små störande RNA. Små RNA och cancer. Etik andlighet onkologi hiv p garyaev* en enfi sammanfattning

Destruktion av mål-mRNA:t kan också ske under påverkan av litet störande RNA (siRNA). RNA-interferens är en av de nya revolutionerande upptäckterna inom molekylärbiologi, och dess författare fick en Nobelpriset. Störande RNA skiljer sig mycket i struktur från andra typer av RNA och är två komplementära RNA-molekyler som är ungefär 21-28 kvävebaser långa, som är förbundna med varandra som strängar i en DNA-molekyl. I detta fall förblir alltid två oparade nukleotider vid kanterna av varje siRNA-kedja. Påverkan utförs enligt följande. När en siRNA-molekyl befinner sig i en cell, binder den i det första skedet till ett komplex med två intracellulära enzymer - helikas och nukleas. Detta komplex kallades RISC ( R NA- i inducerad s dämpning c komplex; tystnad - engelska vara tyst, håll käften; tysta - tysta, det är så processen att "stänga av" en gen kallas i engelska och specialiserad litteratur). Därefter lindar helikaset upp och separerar siRNA-strängarna, och en av strängarna (antisens i strukturen) i komplex med nukleaset interagerar specifikt med den komplementära (som strikt motsvarar det) regionen av mål-mRNA, vilket gör att nukleaset kan skära det. i två delar. De skurna sektionerna av mRNA exponeras sedan för verkan av andra cellulära RNA-nukleaser, som ytterligare skär dem i mindre bitar.

SiRNA som finns i växter och lägre djurorganismer (insekter) är en viktig del av en sorts "intracellulär immunitet" som gör att de kan känna igen och snabbt förstöra främmande RNA. Om ett RNA som innehåller ett virus har kommit in i cellen kommer ett sådant skyddssystem att förhindra att det förökar sig. Om viruset innehåller DNA, kommer siRNA-systemet att förhindra att det producerar virala proteiner (eftersom det nödvändiga mRNA:t för detta kommer att kännas igen och skäras), och användning av denna strategi kommer att bromsa spridningen i hela kroppen. Det har fastställts att siRNA-systemet är extremt diskriminerande: varje siRNA kommer att känna igen och förstöra endast sitt eget specifika mRNA. Ersättning av bara en nukleotid i siRNA leder till en kraftig minskning av interferenseffekten. Ingen av de hittills kända genblockerarna har en sådan exceptionell specificitet för sin målgen.

För närvarande används denna metod främst i vetenskaplig forskning för att identifiera funktionerna hos olika cellulära proteiner. Det kan dock potentiellt också användas för att skapa mediciner.

Upptäckten av RNA-interferens har gett nytt hopp i kampen mot AIDS och cancer. Det är möjligt att genom att använda siRNA-terapi i kombination med traditionella antivirala och anticancerterapier kan en potentieringseffekt uppnås, där de två behandlingarna resulterar i en större terapeutisk effekt än den enkla summan av var och en som ges separat.

För att kunna använda mekanismen för siRNA-interferens i däggdjursceller för terapeutiska ändamål måste färdiga dubbelsträngade siRNA-molekyler införas i cellerna. Det finns dock ett antal problem som för närvarande inte tillåter detta att göras i praktiken, än mindre att skapa några doseringsformer. För det första, i blodet påverkas de av den första delen av kroppens försvar, enzymer - nukleaser, som skär potentiellt farliga och ovanliga dubbelsträngar av RNA för vår kropp. För det andra, trots deras namn, är små RNA fortfarande ganska långa, och viktigast av allt, de bär på en negativ elektrostatisk laddning, vilket gör deras passiva penetration in i cellen omöjlig. Och för det tredje är en av de viktigaste frågorna hur man får siRNA att fungera (eller penetrera) bara i vissa (”sjuka”) celler, utan att påverka friska? Och till sist är det frågan om storlek. Den optimala storleken på sådant syntetiskt siRNA är samma 21-28 nukleotider. Om du ökar dess längd kommer cellerna att svara genom att producera interferon och minska proteinsyntesen. Å andra sidan, om du försöker använda siRNA mindre än 21 nukleotider, minskar specificiteten för dess bindning till önskat mRNA och förmågan att bilda RISC-komplexet kraftigt. Det bör noteras att att övervinna dessa problem är avgörande inte bara för siRNA-terapi, utan också för genterapi i allmänhet.

Vissa framsteg har redan gjorts för att lösa dem. Till exempel försöker forskare kemiska modifieringar göra siRNA-molekyler fler lipofila, det vill säga kan lösas upp i de fetter som utgör cellmembranet och på så sätt underlätta penetreringen av siRNA i cellen. Och för att säkerställa specificiteten för arbetet endast inom vissa vävnader, inkluderar genetiska ingenjörer i sina konstruktioner speciella regulatoriska avsnitt, som aktiveras och utlöser läsningen av informationen som finns i en sådan konstruktion (och därför siRNA, om den ingår där), endast i vissa celltyger.

Så forskare från University of California, San Diego School of Medicine har utvecklat ett nytt effektivt system för att leverera små störande RNA (siRNA), som undertrycker produktionen av vissa proteiner, till celler. Detta system bör bli grunden för teknologi för specifik läkemedelsleverans till olika typer av cancertumörer. "Små störande RNA, som utför en process som kallas RNA-interferens, har en otrolig potential för att behandla cancer," förklarar professor Steven Dowdy, som ledde forskningen: "och även om vi fortfarande har mycket arbete att göra, det här ögonblicket"Vi har utvecklat en teknologi för att leverera läkemedel till en population av celler - både den primära tumören och metastaser, utan att skada friska celler."

I många år har Dowdy och hans kollegor studerat anticancerpotentialen hos små störande RNA. Konventionella siRNA är dock små, negativt laddade molekyler som på grund av sina egenskaper är extremt svåra att leverera till celler. För att uppnå detta använde forskare ett kort signalprotein PTD (peptidtransduktionsdomän). Tidigare skapades mer än 50 "hybridproteiner" med dess användning, där PTD kombinerades med tumörsuppressorproteiner.

Den enkla kopplingen av siRNA med PTD leder dock inte till leverans av RNA in i cellen: siRNA:er är negativt laddade, PTD:er är positivt laddade, vilket resulterar i bildandet av ett tätt RNA-proteinkonglomerat som inte transporteras över cellmembranet . Så forskarna kopplade först PTD till en protein-RNA-bindande domän som neutraliserade den negativa laddningen av siRNA (vilket resulterade i ett fusionsprotein som kallas PTD-DRBD). Ett sådant RNA-proteinkomplex passerar lätt genom cellmembranet och går in i cellcytoplasman, där det specifikt hämmar budbärar-RNA-proteinerna som aktiverar tumörtillväxt.

För att bestämma förmågan hos PTD-DRBD-fusionsproteinet att leverera siRNA till celler, använde forskarna en cellinje som härrörde från mänsklig lungcancer. Efter behandling av celler med PTD-DRBD-siRNA fann man att tumörceller var mest mottagliga för siRNA, medan det i normala celler (T-celler, endotelceller och embryonala stamceller användes som kontroller), där det inte fanns någon ökad produktion av onkogena proteiner observerades inga toxiska effekter.

Den här metoden kan utsättas för olika modifieringar med hjälp av olika siRNA för att undertrycka olika tumörproteiner - inte bara de som produceras i överskott, utan även mutanta. Det är också möjligt att modifiera behandlingen vid återfall av tumörer, som vanligtvis blir resistenta mot cytostatika på grund av nya mutationer.

Onkologiska sjukdomar är mycket varierande och de molekylära egenskaperna hos tumörcellsproteiner är individuella för varje patient. Författarna till arbetet tror att i denna situation är användningen av små störande RNA det mest rationella tillvägagångssättet för terapi.

I en levande cell torkar aldrig informationsflödet mellan kärnan och cytoplasman ut, men att förstå alla dess "virvlar" och dechiffrera informationen som är kodad i den är verkligen en herkulisk uppgift. Ett av förra seklets viktigaste genombrott inom biologi kan betraktas som upptäckten av informations- (eller matris-) RNA (mRNA eller mRNA)-molekyler, som fungerar som mellanhänder som bär informations-"meddelanden" från kärnan (från kromosomerna) till cytoplasman. . RNA:s avgörande roll i proteinsyntesen förutspåddes redan 1939 i Thorbjörn Kasperssons arbete ( Torbjörn Caspersson), Jean Brachet ( Jean Brachet) och Jack Schultz ( Jack Schultz), och 1971 George Marbeis ( George Marbaix) utlöste hemoglobinsyntes i grodaoocyter genom att injicera det första isolerade kaninbudbärar-RNA:t som kodar för detta protein.

Åren 1956–1957 i Sovjetunionen bevisade A. N. Belozersky och A. S. Spirin oberoende förekomsten av mRNA och fick också reda på att huvuddelen av RNA i en cell inte är mall, utan ribosomalt RNA(rRNA). Ribosomalt RNA - den andra "huvudsakliga" typen av cellulärt RNA - bildar "skelettet" och funktionella centrum för ribosomer i alla organismer; Det är rRNA (och inte proteiner) som reglerar huvudstadierna av proteinsyntes. Samtidigt beskrevs och studerades den tredje "huvudsakliga" typen av RNA - överförings-RNA (tRNA), som i kombination med två andra - mRNA och rRNA - bildar ett enda proteinsyntetiserande komplex. Enligt den ganska populära "RNA-världen"-hypotesen var det denna nukleinsyra som låg i själva ursprunget till livet på jorden.

På grund av det faktum att RNA är mycket mer hydrofilt jämfört med DNA (på grund av att deoxiribos ersätts med ribos), är det mer labilt och kan röra sig relativt fritt i cellen, och därför leverera kortlivade kopior av genetisk information (mRNA) till den plats där det börjar proteinsyntesen. Det är dock värt att notera "olägenheten" som är förknippad med detta - RNA är mycket instabilt. Det är mycket sämre lagrat än DNA (även inuti en cell) och bryts ned vid minsta förändring i förhållandena (temperatur, pH). Utöver den "egen" instabiliteten tillhör ett stort bidrag ribonukleaser (eller RNaser) - en klass av RNA-klyvande enzymer som är mycket stabila och "allt förekommande" - även huden på försöksledarens händer innehåller tillräckligt med dessa enzymer för att förneka hela experimentet. På grund av detta är det mycket svårare att arbeta med RNA än med proteiner eller DNA - det senare kan i allmänhet lagras i hundratusentals år med praktiskt taget inga skador.

Fantastisk omsorg under arbetet, tri-destillat, sterila handskar, laboratorieglas för engångsbruk - allt detta är nödvändigt för att förhindra RNA-nedbrytning, men att upprätthålla sådana standarder var inte alltid möjligt. Det är därför under en lång tid de uppmärksammade helt enkelt inte de korta "fragmenten" av RNA som oundvikligen kontaminerade lösningarna. Men med tiden blev det klart att, trots alla ansträngningar för att upprätthålla steriliteten i arbetsområdet, "skräp" naturligtvis fortsatte att upptäckas, och sedan visade det sig att tusentals korta dubbelsträngade RNA alltid finns i cytoplasman , utför mycket specifika funktioner och är absolut nödvändiga för normal utveckling av celler och organism.

Principen för RNA-interferens

Apotekare har också blivit intresserade av möjligheten att använda siRNA, eftersom förmågan att specifikt reglera funktionen hos enskilda gener lovar oöverträffade utsikter vid behandling av en mängd sjukdomar. Liten storlek och hög verkningsspecificitet lovar hög effektivitet och låg toxicitet för siRNA-baserade läkemedel; dock lösa problemet leverans siRNA till sjuka celler i kroppen har ännu inte varit framgångsrika - detta beror på bräckligheten och skörheten hos dessa molekyler. Och även om dussintals team nu försöker hitta ett sätt att rikta dessa "magiska kulor" exakt till målet (inuti sjuka organ), har de ännu inte nått synlig framgång. Utöver detta finns det andra svårigheter. Till exempel, i fallet med antiviral terapi, kan den höga selektiviteten för siRNA:s verkan vara en otjänst - eftersom virus snabbt muterar, kommer den modifierade stammen mycket snabbt att förlora känslighet för siRNA som väljs i början av behandlingen: det är känt att att ersätta bara en nukleotid i siRNA leder till en signifikant minskning av interferenseffekten.

Vid det här laget är det värt att påminna om igen - siRNA upptäcktes endast hos växter, ryggradslösa djur och encelliga organismer; Även om homologer av proteiner för RNA-interferens (Dicer, RISC-komplex) också finns i högre djur, upptäcktes inte siRNA med konventionella metoder. Vilken överraskning det var när artificiellt införd syntetiska siRNA-analoger orsakade en stark specifik dosberoende effekt i däggdjurscellkulturer! Detta innebar att i ryggradsdjursceller ersattes RNA-interferens inte av mer komplexa immunsystem, utan utvecklades tillsammans med organismerna och förvandlades till något mer "avancerat". Följaktligen var det hos däggdjur nödvändigt att inte leta efter exakta analoger av siRNA, utan efter deras evolutionära efterföljare.

Spelare #2 - mikroRNA

Faktum är att, baserat på den evolutionärt uråldriga mekanismen för RNA-interferens, dök två specialiserade system för att kontrollera geners arbete upp i mer utvecklade organismer, var och en med sin egen grupp av små RNA - mikroRNA(mikroRNA) och piRNA(piRNA, Piwi-interagerande RNA). Båda systemen dök upp i svampar och coelenterater och utvecklades tillsammans med dem, och ersatte siRNA och mekanismen för "naken" RNA-interferens. Deras roll för att tillhandahålla immunitet minskar, eftersom denna funktion har tagits över av mer avancerade mekanismer för cellulär immunitet, i synnerhet interferonsystemet. Detta system är dock så känsligt att det också triggas av siRNA självt: uppkomsten av litet dubbelsträngat RNA i en däggdjurscell utlöser en "larmsignal" (aktiverar utsöndringen av interferon och orsakar uttrycket av interferonberoende gener, som blockerar alla översättningsprocesser helt). I detta avseende medieras mekanismen för RNA-interferens hos högre djur huvudsakligen av mikroRNA och piRNA - enkelsträngade molekyler med en specifik struktur som inte detekteras av interferonsystemet.

När genomet blev mer komplext blev mikroRNA och piRNA allt mer involverade i regleringen av transkription och translation. Med tiden förvandlades de till ett ytterligare, exakt och subtilt system för genomreglering. Till skillnad från siRNA produceras inte mikroRNA och piRNA (upptäckt 2001, se ruta 3) från främmande dubbelsträngade RNA-molekyler, utan kodas initialt i värdgenomet.

Möt: microRNA

MikroRNA-prekursorn transkriberas från båda strängarna av genomiskt DNA av RNA-polymeras II, vilket resulterar i uppkomsten av en mellanform - pri-mikroRNA - som bär egenskaperna hos en vanlig mRNA - m 7 G-cap och polyA-svans. Denna prekursor bildar en slinga med två enkelsträngade "svansar" och flera oparade nukleotider i mitten (fig. 3). En sådan slinga genomgår tvåstegsbearbetning (fig. 4): först skär endonukleaset Drosha av enkelsträngade RNA-"svansar" från hårnålen, varefter den utskurna hårnålen (pre-mikroRNA) exporteras till cytoplasman, där den igenkänns av Dicer, som gör ytterligare två snitt (en dubbelsträngad sektion skärs ut, indikerad med färg i fig. 3). I denna form ingår det mogna mikroRNA, liknande siRNA, i RISC-komplexet.

Figur 3. Struktur av en dubbelsträngad mikroRNA-prekursormolekyl. Huvuddrag: närvaron av konserverade sekvenser som bildar en hårnål; närvaron av en komplementär kopia (mikroRNA*) med två "extra" nukleotider vid 3'-änden; en specifik sekvens (2–8 bp) som bildar ett igenkänningsställe för endonukleaser. Själva mikroRNA:t är markerat i rött - det är vad Dicer skär ut.

Verkningsmekanismen för många mikroRNA liknar verkan av siRNA: ett kort (21–25 nukleotider) enkelsträngat RNA som en del av RISC-proteinkomplexet binder med hög specificitet till det komplementära stället i den 3′ otranslaterade regionen av mål-mRNA. Bindning leder till klyvning av mRNA:t av Ago-proteinet. Aktiviteten hos mikroRNA (jämfört med siRNA) är dock redan mer differentierad - om komplementariteten inte är absolut kan mål-mRNA:t inte brytas ned, utan bara reversibelt blockeras (det blir ingen translation). Samma RISC-komplex kan också användas artificiellt införd siRNA. Detta förklarar varför siRNA tillverkade i analogi med protozoer också är aktiva i däggdjur.

Således kan vi komplettera illustrationen av verkningsmekanismen för RNA-interferens i högre (bilateralt symmetriska) organismer genom att kombinera i en figur handlingsdiagrammet för mikroRNA och bioteknologiskt införda siRNA (Fig. 5).

Figur 5. Generaliserat verkningsschema för artificiella mikroRNA och siRNA(konstgjorda siRNA introduceras i cellen med hjälp av specialiserade plasmider - målinriktad siRNA-vektor).

Funktioner av mikroRNA

De fysiologiska funktionerna hos mikroRNA är extremt olika - i själva verket fungerar de som de viktigaste icke-proteinregulatorerna för ontogenes. mikroRNA avbryter inte, utan kompletterar det "klassiska" schemat för genreglering (inducerare, suppressorer, kromatinkomprimering, etc.). Dessutom är själva syntesen av mikroRNA:n komplext reglerad (vissa pooler av mikroRNA kan aktiveras av interferoner, interleukiner, tumörnekrosfaktor α (TNF-α) och många andra cytokiner). Som ett resultat uppstår ett nätverk på flera nivåer för att stämma en "orkester" med tusentals gener, fantastiskt i sin komplexitet och flexibilitet, men saken slutar inte där.

mikroRNA är mer "universella" än siRNA: "avdelnings"-gener behöver inte vara 100% komplementära - reglering utförs också genom partiell interaktion. Idag är ett av de hetaste ämnena inom molekylärbiologi sökandet efter mikroRNA som fungerar som alternativa regulatorer av kända fysiologiska processer. Till exempel har mikroRNA involverade i regleringen av cellcykeln och apoptos i växter, Drosophila och nematoder redan beskrivits; hos människor reglerar mikroRNA immunsystemet och utvecklingen av hematopoetiska stamceller. Användningen av biochip-baserade teknologier (micro-array screening) har visat att hela pooler av små RNA slås på och av i olika skeden av celllivet. Dussintals specifika mikroRNA har identifierats för biologiska processer, vars uttrycksnivå under vissa förhållanden ändras tusentals gånger, vilket betonar den exceptionella kontrollerbarheten hos dessa processer.

Fram till nyligen trodde man att mikroRNA bara undertrycker - helt eller delvis - geners arbete. Det visade sig dock nyligen att mikroRNA:s verkan kan skilja sig radikalt beroende på cellens tillstånd! I en aktivt delande cell binder mikroRNA till en komplementär sekvens i 3′-regionen av mRNA:t och hämmar proteinsyntes (translation). Men i ett tillstånd av vila eller stress (till exempel när man odlar i en dålig miljö) leder samma händelse till exakt motsatt effekt - ökad syntes av målproteinet!

Utveckling av mikroRNA

Antalet mikroRNA-varianter i högre organismer har ännu inte fastställts helt - enligt vissa uppgifter överstiger det 1% av antalet proteinkodande gener (hos människor, till exempel, säger de att det finns 700 mikroRNA, och detta antal är växer ständigt). mikroRNA reglerar aktiviteten hos cirka 30 % av alla gener (målen för många av dem är ännu inte kända), och det finns både allestädes närvarande och vävnadsspecifika molekyler - till exempel reglerar en sådan viktig pool av mikroRNA mognaden av blodstam. celler.

Den breda uttrycksprofilen i olika vävnader av olika organismer och den biologiska prevalensen av mikroRNA indikerar ett evolutionärt gammalt ursprung. MikroRNA upptäcktes först i nematoder, och under lång tid trodde man att dessa molekyler endast förekommer i svampar och coelenterater; dock upptäcktes de senare i encelliga alger. Intressant nog, när organismer blir mer komplexa, ökar också antalet och heterogeniteten hos miRNA-poolen. Detta indikerar indirekt att komplexiteten hos dessa organismer tillhandahålls, i synnerhet av funktionen hos mikroRNA. Den möjliga utvecklingen av miRNA visas i figur 6.

Figur 6. MicroRNA-diversitet i olika organismer. Ju högre organisation organismen har, desto fler mikroRNA finns i den (talet inom parentes). Arter där de hittades är markerade med rött. enda mikroRNA.

En tydlig evolutionär koppling kan dras mellan siRNA och mikroRNA, baserat på följande fakta:

verkan av båda typerna är utbytbar och förmedlas av homologa proteiner;
siRNA som introduceras i däggdjursceller "stänger av" specifikt de önskade generna (trots viss aktivering av interferonskydd);
mikroRNA upptäcks i allt fler forntida organismer.

Dessa och andra data antyder ursprunget till båda systemen från en gemensam "förfader". Det är också intressant att notera att "RNA"-immunitet som en oberoende prekursor för proteinantikroppar bekräftar teorin om ursprunget till de första livsformerna baserade på RNA, och inte proteiner (kom ihåg att detta är favoritteorin för akademiker A.S. Spirin) .

Ju längre du kommer, desto mer förvirrande blir det. Spelare #3 - piRNA

Även om det bara fanns två "spelare" inom molekylärbiologins arena - siRNA och mikroRNA - verkade huvudsyftet med RNA-interferens helt klart. Faktum är att en uppsättning homologa korta RNA och proteiner i olika organismer utför liknande handlingar; När organismer blir mer komplexa blir funktionaliteten också.

Men i evolutionsprocessen skapade naturen ett annat, evolutionärt senaste och högt specialiserat system baserat på samma framgångsrika princip om RNA-interferens. Det handlar om piRNA (piRNA, från Piwi-interaktion RNA).

Ju mer komplex arvsmassan är organiserad, desto mer utvecklad och anpassad är organismen (eller vice versa? ;-). Men den ökade genomkomplexiteten har också en baksida: ett komplext genetiskt system blir instabil. Detta leder till behovet av mekanismer som är ansvariga för att upprätthålla integriteten hos genomet - annars kommer spontan "blandning" av DNA helt enkelt att inaktivera det. Mobila genetiska element ( MGE) - en av huvudfaktorerna för genominstabilitet - är korta instabila regioner som kan transkriberas autonomt och migrera genom genomet. Aktivering av sådana transposerbara element leder till flera DNA-avbrott i kromosomerna, vilket kan få dödliga konsekvenser.

Antalet MGE ökar icke-linjärt med genomstorleken, och deras aktivitet måste innehållas. För att göra detta använder djur, som börjar med coelenterater, samma fenomen med RNA-interferens. Denna funktion utförs också av korta RNA, men inte de som redan diskuterats, utan en tredje typ av dem - piRNA.

"Porträtt" av piRNA

Funktioner av piRNA

Huvudfunktionen hos piRNA är att undertrycka MGE-aktivitet på nivån för transkription och translation. Man tror att piRNA är aktiva endast under embryogenes, när oförutsägbar genomblandning är särskilt farlig och kan leda till embryots död. Detta är logiskt - när immunsystemet ännu inte har börjat fungera behöver embryots celler ett enkelt men effektivt skydd. Embryot skyddas på ett tillförlitligt sätt från yttre patogener av moderkakan (eller äggskalet). Men utöver detta är försvar också nödvändigt från endogena (interna) virus, främst MGE.

Denna roll för piRNA har bekräftats av erfarenhet - "knockout" eller mutationer av Ago3-, Piwi- eller Aub-generna leder till allvarliga utvecklingsstörningar (och en kraftig ökning av antalet mutationer i genomet hos en sådan organism) och orsakar också infertilitet på grund av störningar i utvecklingen av könsceller.

Distribution och utveckling av piRNA

De första piRNA:erna finns redan i havsanemoner och svampar. Växter tog tydligen en annan väg - Piwi-proteiner hittades inte i dem, och rollen som "nosparti" för transposoner utförs av endonukleaset Ago4 och siRNA.

Hos högre djur - inklusive människor - är piRNA-systemet mycket välutvecklat, men det kan bara hittas i embryonala celler och i fostervattnet endotel. Varför spridningen av piRNA i kroppen är så begränsad återstår att se. Det kan antas att piRNA, precis som alla kraftfulla vapen, endast är fördelaktiga under mycket specifika förhållanden (under fosterutveckling), och i den vuxna kroppen kommer deras aktivitet att orsaka mer skada än nytta. Ändå är antalet piRNAs en storleksordning större än antalet kända proteiner, och de ospecifika effekterna av piRNAs i mogna celler är svåra att förutsäga.

Tabell 1. Egenskaper för alla tre klasserna av korta RNA

	siRNA	mikroRNA	piRNA
Spridning	Växter, Drosophila, C. elegans. Finns inte hos ryggradsdjur	Eukaryoter	Embryonala celler från djur (börjar med coelenterater). Inte i protozoer och växter
Längd	21–22 nukleotider	19–25 nukleotider	24–30 nukleotider
Strukturera	Dubbelsträngad, 19 komplementära nukleotider och två oparade nukleotider i 3′-änden	Enkelkedjig komplex struktur	Enkelkedjig komplex struktur. U vid 5′ ände, 2′ ände O-metylerad 3'-ände
Bearbetning	Tärningsberoende	Tärningsberoende	Dicer-oberoende
Endonukleaser	Sedan 2	Ago1, Ago2	Ago3, Piwi, Aub
Aktivitet	Nedbrytning av komplementära mRNA, acetylering av genomiskt DNA	Nedbrytning eller hämning av translation av mål-mRNA	Nedbrytning av mRNA som kodar för MGE, reglering av MGE-transkription
Biologisk roll	Antiviralt immunförsvar, undertryckande av aktiviteten hos ens egna gener	Reglering av genaktivitet	Undertryckande av MGE-aktivitet under embryogenes

Slutsats

Sammanfattningsvis skulle jag vilja presentera en tabell som illustrerar utvecklingen av proteinapparaten involverad i RNA-interferens (Fig. 9). Man kan se att protozoer har det mest utvecklade siRNA-systemet (proteinfamiljerna Ago, Dicer), och när organismer blir mer komplexa skiftar tyngdpunkten till mer specialiserade system - antalet proteinisoformer för mikroRNA (Drosha, Pasha) och piRNA ( Piwi, Hen1) ökar. Samtidigt minskar mångfalden av enzymer som förmedlar verkan av siRNA.

Figur 9. Mångfald av proteiner involverade i RNA-interferens(siffrorna anger antalet proteiner i varje grupp). Blå element som är karakteristiska för siRNA och mikroRNA är markerade, och röd- protein Och piRNA-relaterad.

Fenomenet RNA-interferens började användas av de enklaste organismerna. Baserat på denna mekanism skapade naturen en prototyp av immunsystemet, och när organismer blir mer komplexa blir RNA-interferens en oumbärlig regulator av genomaktivitet. Två olika mekanismer plus tre typer av korta RNA ( centimeter. flik. 1) - som ett resultat ser vi tusentals fina regulatorer av olika metaboliska och genetiska vägar. Denna slående bild illustrerar mångsidigheten och evolutionära anpassningen av molekylärbiologiska system. Korta RNA bevisar återigen att det inte finns några "små saker" inuti cellen - det finns bara små molekyler, vars fulla betydelse vi bara börjar förstå.

(Det är sant att en sådan fantastisk komplexitet snarare tyder på att evolutionen är "blind" och agerar utan ett förhandsgodkänt " mästerplan» »;

Andrew Grimson, Mansi Srivastava, Bryony Fahey, Ben J. Woodcroft, H. Rosaria Chiang, et. al.. (2008). Tidigt ursprung och utveckling av mikroRNA och Piwi-interagerande RNA hos djur. Natur. 455 , 1193-1197;

A.A. Aravin, G.J. Hannon, J. Brennecke. (2007). Piwi-piRNA Pathway ger ett adaptivt försvar i Transposon Arms Race. Vetenskap. 318 , 761-764;

Metaforen som ligger bakom namnet på RNA-interferensfenomenet hänvisar till experimentet med petunia, när rosa och lila pigmentsyntetasgener artificiellt introducerade i växten inte ökade färgintensiteten, utan tvärtom minskade den. På liknande sätt, i "vanlig" interferens, kan överlagringen av två vågor leda till ömsesidig "avbrytning".

I en levande cell torkar aldrig informationsflödet mellan kärnan och cytoplasman ut, men att förstå alla dess "vändningar" och dechiffrera informationen som är kodad i den är verkligen en herkulisk uppgift. Ett av förra seklets viktigaste genombrott inom biologi kan betraktas som upptäckten av informations- (eller matris-) RNA (mRNA eller mRNA)-molekyler, som fungerar som mellanhänder som bär informations-"meddelanden" från kärnan (från kromosomerna) till cytoplasman. . RNA:s avgörande roll i proteinsyntesen förutspåddes redan 1939 i arbetet av Torbjörn Caspersson, Jean Brachet och Jack Schultz, och 1971 lanserade George Marbaix syntesen av hemoglobin i oocytgrodor genom att injicera kaninbudbärar-RNA som kodar för detta protein för första gången.

1956-57 i Sovjetunionen bevisade A. N. Belozersky och A. S. Spirin oberoende förekomsten av mRNA och fick också reda på att huvuddelen av RNA i en cell inte är mall, utan ribosomalt RNA (rRNA). Ribosomalt RNA, den andra "huvudsakliga" typen av cellulärt RNA, bildar "skelettet" och funktionella centrum för ribosomer i alla organismer; Det är rRNA (och inte proteiner) som reglerar huvudstadierna av proteinsyntes. Samtidigt beskrevs och studerades den tredje "huvudsakliga" typen av RNA - överförings-RNA (tRNA), som i kombination med två andra - mRNA och rRNA - bildar ett enda proteinsyntetiserande komplex. Enligt den ganska populära "RNA-världen"-hypotesen var det denna nukleinsyra som låg i själva ursprunget till livet på jorden.

Fantastisk omsorg under arbetet, tridestillat, sterila handskar, laboratorieglas för engångsbruk - allt detta är nödvändigt för att förhindra RNA-nedbrytning, men att upprätthålla sådana standarder var inte alltid möjligt. Därför uppmärksammade de under lång tid helt enkelt inte korta "fragment" av RNA, som oundvikligen kontaminerade lösningar. Men med tiden blev det klart att, trots alla ansträngningar för att upprätthålla steriliteten i arbetsområdet, "skräp" naturligtvis fortsatte att upptäckas, och sedan visade det sig att tusentals korta dubbelsträngade RNA alltid finns i cytoplasman , utför mycket specifika funktioner och är absolut nödvändiga för normal utveckling av celler och organism.

Principen för RNA-interferens

Idag är studiet av små regulatoriska RNA ett av de snabbast utvecklande områdena inom molekylärbiologin. Det upptäcktes att alla korta RNA utför sina funktioner baserat på ett fenomen som kallas RNA-interferens (essensen av detta fenomen är undertryckandet av genuttryck vid transkriptions- eller translationsstadiet med aktivt deltagande av små RNA-molekyler). Mekanismen för RNA-interferens visas mycket schematiskt i Fig. 1:

Ris. 1. Grunderna för RNA-interferens
Dubbelsträngade RNA (dsRNA)-molekyler är ovanliga i normala celler, men de är ett viktigt steg i många viruss livscykel. Det speciella proteinet Dicer, som har upptäckt dsRNA i cellen, "skär" det i små fragment. Antisenssträngen i ett sådant fragment, som redan kan kallas kort interfererande RNA (siRNA, från siRNA - small interference RNA), är bunden av ett komplex av proteiner som kallas RISC (RNA-induced silencing complex), vars centrala element är ett endonukleas från Argonaute-familjen. Bindning till siRNA aktiverar RISC och utlöser en sökning i cellen efter DNA- och RNA-molekyler som är komplementära till "mallen" siRNA. Sådana molekylers öde är att förstöras eller inaktiveras av RISC-komplexet.

För att sammanfatta, korta "snitt" av främmande (inklusive avsiktligt introducerat) dubbelsträngat RNA fungerar som en "mall" för en storskalig sökning och förstörelse av komplementärt mRNA (och detta är ekvivalent med undertryckande av uttrycket av motsvarande gen) , inte bara i en cell, utan också i angränsande. För många organismer - protozoer, blötdjur, maskar, insekter, växter - är detta fenomen ett av de viktigaste sätten för immunförsvar mot infektioner.

År 2006 fick Andrew Fire och Craig Mello Nobelpriset i fysiologi eller medicin "för deras upptäckt av fenomenet RNA-interferens - mekanismen för gentystnad med deltagande av dsRNA." Även om fenomenet med RNA-interferens i sig hade beskrivits långt tidigare (tillbaka i början av 1980-talet), var det Fire och Mellos arbete som beskrev regleringsmekanismen för små RNA och skisserade ett hittills okänt område av molekylär forskning. Här är de viktigaste resultaten av deras arbete:

Under RNA-interferens är det mRNA (och inget annat) som klyvs;
Dubbelsträngat RNA verkar (orsakar klyvning) mycket mer effektivt än enkelsträngat RNA. Dessa två observationer förutspådde förekomsten av ett specialiserat system som förmedlar verkan av dsRNA;
dsRNA, komplementärt till en sektion av moget mRNA, orsakar klyvning av det senare. Detta indikerade den cytoplasmatiska lokaliseringen av processen och närvaron av ett specifikt endonukleas;
En liten mängd dsRNA (flera molekyler per cell) är tillräcklig för att helt "stänga av" målgenen, vilket indikerar förekomsten av en kaskadmekanism för katalys och/eller amplifiering.

Dessa resultat lade grunden för ett helt område av modern molekylärbiologi - RNA-interferens - och bestämde arbetsvektorn för många forskargrupper runt om i världen i årtionden. Hittills har tre stora grupper av små RNA upptäckts som spelar på det molekylära fältet som "RNA-interferensteamet." Låt oss lära känna dem mer i detalj.

Spelare #1 – kort störande RNA

Specificiteten för RNA-interferens bestäms av kort interfererande RNA (siRNA) - små dubbelsträngade RNA-molekyler med en tydligt definierad struktur (se fig. 2).

siRNA är de tidigaste i evolutionen och är mest utbredda i växter, encelliga organismer och ryggradslösa djur. Hos ryggradsdjur hittas praktiskt taget inga siRNAs normalt, eftersom de ersattes av senare "modeller" av korta RNA (se nedan).

siRNA - "mallar" för att söka i cytoplasman och förstöra mRNA-molekyler - har en längd på 20–25 nukleotider och en "speciell egenskap": 2 oparade nukleotider i 3'-ändarna och fosforylerade 5'-ändar. Anti-sense siRNA är kapabelt (inte i sig självt, men med hjälp av RISC-komplexet) att känna igen mRNA och specifikt orsaka dess nedbrytning: mål-mRNA:t skärs på det exakta stället som är komplementärt till de 10:e och 11:e nukleotiderna i antisens siRNA-kedja.

Ris. 2. Mekanism för "interferens" mellan mRNA och siRNA
"Störande" korta RNA-molekyler kan antingen komma in i cellen från utsidan eller "klippas" på plats från längre dubbelsträngat RNA. Det huvudsakliga proteinet som krävs för att skära dsRNA är Dicer-endonukleaset. Att ”stänga av” genen med interferensmekanismen utförs av siRNA tillsammans med proteinkomplexet RISC, som består av tre proteiner – endonukleaset Ago2 och två hjälpproteiner PACT och TRBP. Senare upptäcktes att Dicer- och RISC-komplexen kan använda som ett "frö" inte bara dsRNA, utan också enkelsträngat RNA som bildar en dubbelsträngad hårnål, såväl som färdigt siRNA (det senare går förbi "skärningen" skede och binder omedelbart till RISC).

Funktionerna hos siRNA i ryggradslösa celler är ganska olika. Det första och viktigaste är immunskydd. Det "traditionella" immunsystemet (lymfocyter + leukocyter + makrofager) finns endast i komplexa flercelliga organismer. Hos encelliga organismer, ryggradslösa djur och växter (som antingen inte har ett sådant system eller så är det i sin linda) bygger immunförsvaret på RNA-interferens. Immunitet baserad på RNA-interferens kräver inte komplexa "tränings"organ för immuncellprekursorer (mjälte, tymus); samtidigt är variationen av teoretiskt möjliga korta RNA-sekvenser (421 varianter) korrelerad med antalet möjliga proteinantikroppar från högre djur. Dessutom syntetiseras siRNA på basis av det "fientliga" RNA som har infekterat cellen, vilket innebär att de, till skillnad från antikroppar, omedelbart "skräddarsys" för en specifik typ av infektion. Och även om skydd baserat på RNA-interferens inte fungerar utanför cellen (åtminstone, det finns inga sådana data ännu), ger det intracellulär immunitet mer än tillfredsställande.

Först och främst skapar siRNA antiviral immunitet genom att förstöra mRNA eller genomiskt RNA från infektiösa organismer (till exempel så här upptäcktes siRNA i växter). Införandet av viralt RNA orsakar kraftfull amplifiering av specifika siRNA baserat på primermolekylen - själva virala RNA:t. Dessutom undertrycker siRNA uttrycket av olika mobila genetiska element (MGE) och ger därför skydd mot endogena "infektioner." Mutationer i generna av RISC-komplexet leder ofta till ökad genominstabilitet på grund av hög MGE-aktivitet; siRNA kan agera som en begränsare på uttrycket av sina egna gener, utlösande som svar på deras överuttryck. Reglering av genfunktion kan ske inte bara på translationsnivå, utan också under transkription - genom metylering av gener vid histon H3.

I modern experimentell biologi kan betydelsen av RNA-interferens och korta RNA knappast överskattas. En teknik har utvecklats för att "stänga av" (eller slå ner) enskilda gener in vitro (på cellkulturer) och in vivo (på embryon), vilket redan har blivit en de facto-standard när man studerar vilken gen som helst. Ibland, även för att fastställa enskilda geners roll i någon process, "stänger de systematiskt av" alla gener i sin tur.

Apotekare har också blivit intresserade av möjligheten att använda siRNA, eftersom förmågan att specifikt reglera funktionen hos enskilda gener lovar oöverträffade utsikter vid behandling av en mängd sjukdomar. Liten storlek och hög verkningsspecificitet lovar hög effektivitet och låg toxicitet för siRNA-baserade läkemedel; Det har dock ännu inte varit möjligt att lösa problemet med att leverera siRNA till sjuka celler i kroppen – detta beror på dessa molekylers bräcklighet och skörhet. Och även om dussintals team nu försöker hitta ett sätt att rikta dessa "magiska kulor" exakt till målet (inuti sjuka organ), har de ännu inte nått synlig framgång. Utöver detta finns det andra svårigheter. Till exempel, i fallet med antiviral terapi, kan den höga selektiviteten för siRNA:s verkan vara en otjänst - eftersom virus muterar snabbt kommer den modifierade stammen mycket snabbt att förlora känslighet för siRNA som väljs i början av behandlingen: det är känt att att ersätta bara en nukleotid i siRNA leder till en signifikant minskning av interferenseffekten.

Vid denna tidpunkt är det värt att påminna om igen - siRNA hittades endast i växter, ryggradslösa djur och encelliga organismer; Även om homologer av proteiner för RNA-interferens (Dicer, RISC-komplex) också finns i högre djur, upptäcktes inte siRNA med konventionella metoder. Vilken överraskning det var när artificiellt introducerade syntetiska siRNA-analoger orsakade en stark specifik dosberoende effekt i däggdjurscellkulturer! Detta innebar att i ryggradsdjursceller ersattes RNA-interferens inte av mer komplexa immunsystem, utan utvecklades tillsammans med organismerna och förvandlades till något mer "avancerat". Följaktligen var det hos däggdjur nödvändigt att inte leta efter exakta analoger av siRNA, utan efter deras evolutionära efterföljare.

Spelare #2 – mikroRNA

Faktum är att, baserat på den evolutionärt uråldriga mekanismen för RNA-interferens, har mer utvecklade organismer utvecklat två specialiserade system för att kontrollera driften av gener, som var och en använder sin egen grupp av små RNA - mikroRNA och piRNA (Piwi-interagerande RNA). Båda systemen dök upp i svampar och coelenterater och utvecklades tillsammans med dem, och ersatte siRNA och mekanismen för "naken" RNA-interferens. Deras roll för att tillhandahålla immunitet minskar, eftersom denna funktion har tagits över av mer avancerade mekanismer för cellulär immunitet, i synnerhet interferonsystemet. Detta system är dock så känsligt att det också triggas av siRNA självt: uppkomsten av litet dubbelsträngat RNA i en däggdjurscell utlöser en "larmsignal" (aktiverar utsöndringen av interferon och orsakar uttrycket av interferonberoende gener, som blockerar alla översättningsprocesser helt). I detta avseende medieras mekanismen för RNA-interferens hos högre djur huvudsakligen av mikroRNA och piRNA - enkelsträngade molekyler med en specifik struktur som inte detekteras av interferonsystemet.

När genomet blev mer komplext blev mikroRNA och piRNA allt mer involverade i regleringen av transkription och translation. Med tiden förvandlades de till ett ytterligare, exakt och subtilt system för genomreglering. Till skillnad från siRNA produceras inte mikroRNA och piRNA (upptäckt 2001, se fig. 3, A-B) från främmande dubbelsträngade RNA-molekyler, utan kodas initialt i värdorganismens genom.

MikroRNA-prekursorn transkriberas från båda strängarna av genomiskt DNA av RNA-polymeras II, vilket resulterar i uppkomsten av en mellanform - pri-mikroRNA - som bär egenskaperna hos vanlig mRNA - m7G cap och polyA svans. Denna prekursor bildar en slinga med två enkelsträngade svansar och flera oparade nukleotider i mitten (Fig. 3A). En sådan slinga genomgår tvåstegsbearbetning (Fig. B): först skär endonukleaset Drosha av enkelsträngade RNA-"svansar" från hårnålen, varefter den avskurna hårnålen (pre-mikroRNA) exporteras till cytoplasman, där den igenkänns av Dicer, som gör ytterligare två snitt (en dubbelsträngad sektion skärs ut, indikerad med färg i fig. 3A). I denna form ingår det mogna mikroRNA, liknande siRNA, i RISC-komplexet.

Verkningsmekanismen för många mikroRNA liknar verkan av siRNA: ett kort (21–25 nukleotider) enkelsträngat RNA som en del av RISC-proteinkomplexet binder med hög specificitet till det komplementära stället i den 3'-otranslaterade regionen av mål-mRNA. Bindning leder till klyvning av mRNA:t av Ago-proteinet. Aktiviteten hos mikroRNA (jämfört med siRNA) är dock redan mer differentierad - om komplementariteten inte är absolut kan mål-mRNA:t inte brytas ned, utan bara reversibelt blockeras (det blir ingen translation). Samma RISC-komplex kan också använda artificiellt införda siRNA. Detta förklarar varför siRNA tillverkade i analogi med protozoer också är aktiva i däggdjur.

Ris. 3A: Struktur av en dubbelsträngad mikroRNA-prekursormolekyl
Huvuddrag: närvaron av konserverade sekvenser som bildar en hårnål; närvaron av en komplementär kopia (mikroRNA*) med två "extra" nukleotider vid 3'-änden; en specifik sekvens (2–8 bp) som bildar ett igenkänningsställe för endonukleaser. Själva mikroRNA:t är markerat i rött - det är vad Dicer skär ut.

Ris. 3B: Allmän mekanism för mikroRNA-bearbetning och implementering av dess aktivitet

Ris. 3B: Generaliserat verkningsschema för artificiella mikroRNA och siRNA
Konstgjorda siRNA introduceras i cellen med hjälp av specialiserade plasmider (inriktad siRNA-vektor).

Funktioner av mikroRNA

Fram till nyligen trodde man att mikroRNA endast undertrycker – helt eller delvis – geners funktion. Det visade sig dock nyligen att mikroRNA:s verkan kan skilja sig radikalt beroende på cellens tillstånd! I en aktivt delande cell binder mikroRNA till en komplementär sekvens i 3'-regionen av mRNA och hämmar proteinsyntes (translation). Men i ett tillstånd av vila eller stress (till exempel när man odlar i en dålig miljö) leder samma händelse till exakt motsatt effekt - ökad syntes av målproteinet!

Utveckling av mikroRNA

Antalet mikroRNA-varianter i högre organismer har ännu inte fastställts helt enligt vissa data, det överstiger 1% av antalet proteinkodande gener (hos människor, till exempel, säger de cirka 700 mikroRNA, och detta antal är konstant; växande). mikroRNA reglerar aktiviteten hos cirka 30 % av alla gener (målen för många av dem är ännu inte kända), och det finns både allestädes närvarande och vävnadsspecifika molekyler - till exempel reglerar en sådan viktig pool av mikroRNA mognaden av blodstam. celler.

Ris. 4. Mångfald av mikroRNA i olika organismer
Ju högre organisation organismen har, desto fler mikroRNA finns i den (talet inom parentes). Arter där enskilda mikroRNA hittades är markerade i rött. Enligt .

En tydlig evolutionär koppling kan dras mellan siRNA och mikroRNA, baserat på följande fakta:

verkan av båda typerna är utbytbar och förmedlas av homologa proteiner;
siRNA som introduceras i däggdjursceller "stänger av" specifikt de önskade generna (trots viss aktivering av interferonskydd);
mikroRNA upptäcks i allt fler forntida organismer.

Men i evolutionsprocessen skapade naturen ett annat, evolutionärt senaste och högt specialiserat system baserat på samma framgångsrika princip om RNA-interferens. Vi pratar om piRNA (piRNA, från Piwi-interaktions-RNA).

Ju mer komplex arvsmassan är organiserad, desto mer utvecklad och anpassad är organismen (eller vice versa? ;-). Men att öka genomkomplexiteten har också en baksida: ett komplext genetiskt system blir instabilt. Detta leder till behovet av mekanismer som är ansvariga för att upprätthålla integriteten hos genomet - annars kommer spontan "blandning" av DNA helt enkelt att inaktivera det. Mobila genetiska element (MGE), en av huvudfaktorerna för genominstabilitet, är korta instabila regioner som kan transkriberas autonomt och migrera genom genomet. Aktivering av sådana transposerbara element leder till flera DNA-avbrott i kromosomerna, vilket kan få dödliga konsekvenser.

Antalet MGE ökar icke-linjärt med genomstorleken, och deras aktivitet måste innehållas. För att göra detta använder djur, som börjar med coelenterater, samma fenomen med RNA-interferens. Denna funktion utförs också av korta RNA, men inte av de som redan diskuterats, utan av en tredje typ - piRNA.

"Porträtt" av piRNA

piRNA är korta molekyler 24-30 nukleotider långa, kodade i de centromera och telomera regionerna av kromosomen. Sekvenserna för många av dem är komplementära till kända mobila genetiska element, men det finns många andra piRNA som sammanfaller med regioner av arbetande gener eller med genomfragment vars funktioner är okända.

piRNA (liksom mikroRNA) kodas i båda strängarna av genomiskt DNA; de är mycket varierande och mångsidiga (upp till 500 000 (!) arter i en organism). Till skillnad från siRNA och mikroRNA, bildas de av en enda kedja med en karakteristisk egenskap - uracil (U) i 5'-änden och en metylerad 3'-ände. Det finns andra skillnader:

Till skillnad från siRNA och mikroRNA kräver de inte bearbetning av Dicer;
piRNA-gener är endast aktiva i könsceller (under embryogenes) och de omgivande endotelcellerna;
Proteinsammansättningen i piRNA-systemet är annorlunda - dessa är endonukleaser av Piwi-klassen (Piwi och Aub) och en separat variant av Argonaute - Ago3.

Bearbetningen och aktiviteten av piRNA är fortfarande dåligt förstådd, men det är redan klart att verkningsmekanismen är helt annorlunda än andra korta RNA - idag har en pingismodell av deras arbete föreslagits (Fig. 5 A, B).

Ping-pong-mekanism för piRNA-biogenes

Ris. 5A: Cytoplasmatisk del av piRNA-bearbetning
Biogenes och aktivitet av piRNA förmedlas av Piwi-familjen av endonukleaser (Ago3, Aub, Piwi). Aktiviteten av piRNA tillhandahålls av både enkelsträngade piRNA-molekyler - sense och anti-sense - som var och en associerar med ett specifikt Piwi-endonukleas. PiRNA:t känner igen den komplementära regionen av transposon-mRNA:t (blå sträng) och skär ut det. Detta inaktiverar inte bara transposonet, utan skapar också ett nytt piRNA (kopplat till Ago3 via metylering av 3'-änden av Hen1-metylas). Detta piRNA känner i sin tur igen mRNA med transkript från piRNA-prekursorklustret (röd sträng) - på så sätt stängs cykeln och det önskade piRNA produceras igen.

Ris. 5B: piRNA i kärnan
Förutom Aub-endonukleaset kan Piwi-endonukleaset också binda antisens-piRNA. Efter bindning migrerar komplexet in i kärnan, där det orsakar nedbrytning av komplementära transkript och kromatinomlagring, vilket orsakar undertryckande av transposonaktivitet.

Funktioner av piRNA

Distribution och utveckling av piRNA

Hos högre djur, inklusive människor, är piRNA-systemet mycket väl utvecklat, men det kan bara hittas i embryonala celler och i fostervattnet endotel. Varför spridningen av piRNA i kroppen är så begränsad återstår att se. Det kan antas att piRNA, precis som alla kraftfulla vapen, endast är fördelaktiga under mycket specifika förhållanden (under fosterutveckling), och i den vuxna kroppen kommer deras aktivitet att orsaka mer skada än nytta. Ändå överstiger antalet piRNAs antalet kända proteiner med en storleksordning, och de ospecifika effekterna av piRNAs i mogna celler är svåra att förutsäga.

Pivottabell. Egenskaper för alla tre klasserna av korta RNA

	siRNA	mikroRNA	piRNA
Spridning	Växter, Drosophila, C. elegans. Finns inte hos ryggradsdjur	Eukaryoter	Embryonala celler från djur (börjar med coelenterater). Inte i protozoer och växter
Längd	21-22 nukleotider	19-25 nukleotider	24-30 nukleotider
Strukturera	Dubbelsträngad, 19 komplementära nukleotider och två oparade nukleotider i 3'-änden	Enkelkedjig komplex struktur	Enkelkedjig komplex struktur. U vid 5'-änden, 2'- O-metylerad 3'-ände
Bearbetning	Tärningsberoende	Tärningsberoende	Dicer-oberoende
Endonukleaser	Sedan 2	Ago1, Ago2	Ago3, Piwi, Aub
Aktivitet	Nedbrytning av komplementära mRNA, acetylering av genomiskt DNA	Nedbrytning eller hämning av translation av mål-mRNA	Nedbrytning av mRNA som kodar för MGE, reglering av MGE-transkription
Biologisk roll	Antiviralt immunförsvar, undertryckande av aktiviteten hos ens egna gener	Reglering av genaktivitet	Undertryckande av MGE-aktivitet under embryogenes

Slutsats

Sammanfattningsvis skulle jag vilja ge en tabell som illustrerar utvecklingen av proteinapparaten involverad i RNA-interferens (Fig. 6). Man kan se att protozoer har det mest utvecklade siRNA-systemet (proteinfamiljerna Ago, Dicer), och när organismer blir mer komplexa skiftar tyngdpunkten till mer specialiserade system - antalet proteinisoformer för mikroRNA (Drosha, Pasha) och piRNA ( Piwi, Hen1) ökar. Samtidigt minskar mångfalden av enzymer som förmedlar verkan av siRNA.

Ris. 6. Mångfald av proteiner involverade i RNA-interferens Och
Siffrorna anger antalet proteiner i varje grupp. Element som är karakteristiska för siRNA och mikroRNA är markerade i blått, och proteiner associerade med piRNA är markerade i rött. Enligt .

Fenomenet RNA-interferens började användas av de enklaste organismerna. Baserat på denna mekanism skapade naturen en prototyp av immunsystemet, och när organismer blir mer komplexa blir RNA-interferens en oumbärlig regulator av genomaktivitet. Två olika mekanismer plus tre typer av korta RNA (se sammanfattande tabell) - som ett resultat ser vi tusentals fina regulatorer av olika metaboliska och genetiska vägar. Denna slående bild illustrerar mångsidigheten och evolutionära anpassningen av molekylärbiologiska system. Korta RNA bevisar återigen att det inte finns några "små saker" inuti cellen - det finns bara små molekyler, vars fulla betydelse vi bara börjar förstå.

Det är sant att en sådan fantastisk komplexitet snarare tyder på att evolutionen är "blind" och agerar utan en förhandsgodkänd "masterplan".

Litteratur

Gurdon J.B., Lane C.D., Woodland H.R., Marbaix G. (1971). Användning av grodägg och oocyter för studiet av budbärar-RNA och dess översättning i levande celler. Nature 233, 177-182;
Spirin A.S. (2001). Proteinbiosyntes, RNA-världen och livets ursprung. Bulletin of the Russian Academy of Sciences 71, 320-328;
Element: "Fullständiga mitokondriella genom från utdöda djur kan nu extraheras från hår";
Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. (1998). Potent och specifik genetisk störning av dubbelsträngat RNA i Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-311;
Biomolekyl: "MikroRNA upptäcktes för första gången i en encellig organism";
Covey S., Al-Kaff N., Lángara A., Turner D. (1997). Växter bekämpar infektion genom gentystnad. Nature 385, 781-782;
Biomolekyl: "Molekylär dubbelhandel: mänskliga gener fungerar för influensaviruset";
Ren B. (2010). Transkription: Enhancers gör icke-kodande RNA. Nature 465, 173–174;
Taganov K.D., Boldin M.P., Chang K.J., Baltimore D. (2006). NF-KB-beroende induktion av mikroRNA miR-146, en hämmare inriktad på att signalera proteiner av medfödda immunsvar. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 12481-12486;
O'Connell R.M., Rao D.S., Chaudhuri A.A., Boldin M.P., Taganov K.D., Nicoll J., Paquette R.L., Baltimore D. (2008). Ihållande uttryck av mikroRNA-155 i hematopoetiska stamceller orsakar en myeloproliferativ störning. J. Exp. Med. 205, 585-594;
Biomolekyl: "mikroRNA – ju längre in i skogen, desto mer ved";
Element: "Kroppens komplikation hos forntida djur var förknippad med uppkomsten av nya reglerande molekyler";
Grimson A., Srivastava M., Fahey B., Woodcroft B.J., Chiang H.R., King N., Degnan B.M., Rokhsar D.S., Bartel D.P. (2008). Tidigt ursprung och utveckling av mikroRNA och Piwi-interagerande RNA hos djur. Nature 455, 1193–1197.
Aravin A., Hannon G., Brennecke J. (2007). Piwi-piRNA Pathway ger ett adaptivt försvar i Transposon Arms Race. Science 318, 761–764;
Biomolekyl: "

A.M. Deichman, S.V. Zinoviev, A.Yu

GENEXPRESSION OCH SMÅ RNAS INOM ONKOLOGI

GU RONC im. N.N.Blokhin RAMS, Moskva

SAMMANFATTNING

Artikeln presenterar rollen för små RNA som kontrollerar de flesta av de vitala funktionerna i cellen och kroppen, och deras möjliga koppling, i synnerhet, med onkogenes och andra (inklusive hypotetiska) intracellulära mekanismer för genomiskt uttryck.

Nyckelord: små RNA, RNA-interferens (RNAi), dubbelsträngat RNA (dsRNA), RNA-redigering, onkogenes.

A.M. Deichman, S.V.Zinoviev, A.Yu.Baryshnikov.

GENEXPRESSIONET OCH SMÅ RNAS INOM ONKOLOGIN

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moskvaaj

ABSTRAKT

I pappersrollen för små RNA som övervakar de flesta vitala funktionerna hos cell och organism och eventuell koppling av dem i synnerhet med onkogenes och andra (inklusive hypotetiska) intracellulära mekanismer för genomuttryck lämnas in.

Nyckelord: Små RNA, interferens-RNA (RNAi), dubbelsträngade RNA (dsRNA), RNA-redigering, tumörogenes.

Introduktion

Uttryck av individuella gener och hela eukaryota genom, inklusive bearbetning, olika sorter transkription, splitsning, omarrangemang, RNA-redigering, rekombination, translation, RNA-interferens, reglerad av vissa proteiner (produkter av regulatoriska, strukturella, homeotiska gener, transkriptionsfaktorer), mobila element, RNA och effektorer med låg molekylvikt. Bland bearbetnings-RNA finns rRNA, tRNA, mRNA, vissa typer av regulatoriskt RNA och litet RNA.

Det är nu känt att små RNA inte kodar för proteiner, ofta uppgår till hundratals per genom, och är involverade i regleringen av uttrycket av olika eukaryota gener (somatiska, immuna, germinala, stamceller). Differentieringsprocesserna (hematopoies, angiogenes, adipogenes, myogenes, neurogenes), morfogenes (inklusive embryonala stadier, utveckling/tillväxt, fysiologisk reglering), proliferation, apoptos, karcinogenes, mutagenes, immunogenes, åldrande (livsförlängning), är under epigenetiska kontroll ; fall av metabolisk reglering (till exempel glykosfingolipider) har noterats. En bredare klass av icke-kodande RNA på 20-300/500 nukleotider och deras RNP finns inte bara i kärnan/nukleolus/cytoplasman, utan också i DNA-innehållande cellulära organeller (djurmitokondrier; mikroRNA och små konsensussekvenser för kloroplasttranskript) har hittats i växternas RNA).

För kontroll och reglering av v.n. processer är det viktigt: 1. att små naturliga/konstgjorda RNA (små RNA, tRNA, etc.) och deras komplex med proteiner (RNP) är kapabla till transmembran cellulär och mitokondriell transport; 2. att efter nedbrytningen av mitokondrier kan en del av deras innehåll, RNA och RNP, hamna i cytoplasman och kärnan. De listade egenskaperna hos små RNA (SRNA), vars funktionellt betydelsefulla roll bara ökar i studieprocessen, har uppenbarligen ett samband med vakenhetsfaktorn för cancer och andra genetiska sjukdomar. Samtidigt blev det tydligare mycket viktigt epigenomiska modifieringar av kromatin under förekomsten av tumörer. Vi kommer endast att överväga ett mycket begränsat antal fall av många liknande.

Små RNA

Verkningsmekanismen för små RNA är deras förmåga att binda nästan komplementärt till de 3"-otranslaterade regionerna (3"-UTR) av mål-mRNA (som ibland innehåller DNA/RNA-transponerande MIR/LINE-2-element, såväl som konservativt Alu upprepas ) och orsaka RNA-interferens (RNAi=RNAi; i synnerhet under ett antiviralt svar). Komplikationen är dock att det förutom cellulära sådana också finns viruskodade små RNA (herpes, SV40, etc.; EBV, till exempel, innehåller 23 och KSHV - 12 miRNA) som interagerar med transkript av både virus och värden. Mer än 5 tusen cellulära/virala miRNA enbart är kända i 58 arter. RNAi initierar antingen nedbrytning (med deltagande av RISC-komplexet, RNA-induced Silencing Complex) längs nukleaskänsliga fragment av kontinuerliga lncRNA-helixar (dubbelsträngat RNA-mRNA, etc.), eller delvis reversibel hämning av diskontinuerligt spiralformade lncRNA under translation av mål-mRNA. Mogna små RNA (~15-28 nukleotider) bildas i cytoplasman från deras kärnbearbetade prekursorer av varierande längd (tiotals och hundratals nukleotider). Dessutom är små RNA involverade i bildandet av den tysta kromatinstrukturen, reglering av transkription av individuella gener, undertryckande av transposonuttryck och upprätthållande av den funktionella strukturen av förlängda regioner av heterokromatin.

Det finns flera huvudtyper av små RNA. De mest väl studerade är mikroRNA (miRNA) och små interfererande RNA (siRNA). Dessutom, bland små RNA, studeras följande: piRNA aktiva i könsceller; små interfererande RNA associerade med endogena retrotransposoner och upprepande element (med lokal/global heterokromatisering - med början från de tidiga stadierna av embryogenes; bibehåll telomernivån), Drosophila rasiRNA; kodas ofta av introner av proteingener och är funktionellt viktiga vid translation, transkription, splitsning (de-/metylering, pseudouridylering av nukleinsyror) små nukleära (snRNAs) och nukleolära (snoRNAs) RNA; små modulator-RNA, smRNA, med föga kända funktioner, komplementära till de DNA-bindande NRSE (Neuron Restrictive Silencer Element) motiven; växttransaktiverande små störande RNA, tasiRNA; kort hårnåls-RNA, shRNA, tillhandahåller långtids-RNAi (stabil gentystnad) av långa lncRNA-strukturer under det antivirala svaret hos djur.

Små RNA (miRNA, siRNA, etc.) interagerar med nyligen syntetiserade transkript av kärnan/cytoplasman (reglerar splitsning, translation av mRNA; metylering/pseudouridylering av rRNA, etc.) och kromatin (under tillfällig lokal och epigenetiskt nedärvd somatisk heterokromat) könsceller). Heterokromatinisering, i synnerhet, åtföljs av DNA-de-/metylering, såväl som metylering, acetylering, fosforylering och ubiquitinering av histoner (modifiering av "histonkoden").

Den första bland små RNA var miRNA från nematoden Caenorhabditis elegans (lin-4), deras egenskaper och gener, och något senare miRNA från växten Arabidopsis thaliana. För närvarande är de associerade med flercelliga organismer, även om de visas i den encelliga algen Chlamydomonas reinhardtii, och RNAi-liknande tystande vägar, i samband med antiviralt/liknande skydd som involverar sk. psiRNA, diskuterat för prokaryoter. Genomen av många eukaryoter (inklusive Drosophila och människor) innehåller flera hundra miRNA-gener. Dessa stadium-/vävnadsspecifika gener (liksom deras motsvarande mål-mRNA-regioner) är ofta mycket homologa i fylogenetiskt avlägsna arter, men några av dem är härstamningsspecifika. miRNA finns i exoner (proteinkodande, RNA-gener), introner (oftast pre-mRNA), intergena spacers (inklusive upprepningar), har en längd på upp till 70-120 nukleotider (eller mer) och bildar hårnålsögla/stam strukturer. För att bestämma deras gener används inte bara biokemiska och genetiska tillvägagångssätt, utan även datoransatser.

Den mest typiska längden på "arbetsregionen" av mogna miRNA är 21-22 nukleotider. Dessa är kanske de mest talrika av de icke-proteinkodande generna. De kan lokaliseras i form av individuella kopior (oftare) eller kluster som innehåller många liknande eller olika miRNA-gener, transkriberade (ofta från autonoma promotorer) som en längre prekursor, bearbetade i flera steg till individuella miRNA. Man tror att det finns ett miRNA-reglerande nätverk som kontrollerar många grundläggande biologiska processer (inklusive tumörbildning/metastaser); förmodligen är minst 30% av mänskliga uttryckta gener reglerade av miRNA.

Denna process involverar de lncRNA-specifika RNas III-liknande enzymerna Drosha (nukleärt ribonukleas; initierar bearbetningen av introniska pre-miRNA efter splitsning av huvudtranskriptet) och Dicer, som fungerar i cytoplasman och klyver/nedbryter respektive hårnålspre- miRNA (för att mogna miRNA) och hybrid miRNA/mRNA-strukturer bildas senare. Små RNA, tillsammans med flera proteiner (inklusive vn RNaser, AGO-familjens proteiner, transmetylaser/acetylaser etc.) och med deltagande av s.k. RISC- och RITS-liknande komplex (det andra inducerar transkriptionell tystnad) är kapabla att orsaka RNAi/nedbrytning och efterföljande gentystnad vid RNA-nivåerna (före/under translation) och DNA (under transkription av heterokromatin).

Varje miRNA parar potentiellt med flera mål, och varje mål kontrolleras av ett antal miRNA (påminner om gRNA-medierad pre-mRNA-redigering i trypanosomkinetoplaster). In vitro-analys har visat att miRNA-reglering (liksom RNA-redigering) är en viktig post-transkriptionell modulator av genuttryck. Liknande miRNA som konkurrerar om samma mål är potentiella transregulatorer av RNA-RNA- och RNA-proteininteraktioner.

Hos djur studeras miRNA bäst i nematoden Caenorhabditis Elegans; mer än 112 gener har beskrivits. Tusentals endogena siRNA (inga gener; särskilt associerade med spermatogenes-medierade transkript och transposoner) finns också här. Båda små RNA från metazoer kan genereras av RNA-polymeraser som uppvisar aktiviteten (inte homologi) av RdRP-II (som för de flesta andra RNA) och RdRP-III-typer. Mogna små RNA:n har liknande sammansättning (inklusive terminala 5"-fosfater och 3"-OH), längd (vanligtvis 21-22 nukleotider) och funktion, och kan konkurrera om samma mål. Men RNA-nedbrytning, även med fullständig målkomplementaritet, är oftare associerad med siRNA; translationell repression, med partiell, vanligtvis 5-6 nukleotider, komplementaritet - med miRNA; och prekursorerna, respektive, är exo-/endogena (hundratals/tusentals nukleotider) för siRNA, och vanligtvis endogena (tiotals/hundratals nukleotider) för miRNA och deras biogenes är annorlunda; Men i vissa system är dessa skillnader reversibla.

RNAi, förmedlat av siRNA och miRNA, har en mängd naturliga roller: från reglering av genuttryck och heterokromatin till genomskydd mot transposoner och virus; men siRNA och vissa miRNA är inte konserverade mellan arter. I växter (Arabidopsis thaliana) hittades följande: siRNA som motsvarar både gener och intergena (inklusive spacers, upprepningar) regioner; ett stort antal potentiella genomplatser för olika typer små RNA. Nematoder har också sk variabla autonomt uttryckta 21U-RNA (dasRNA); de har ett 5"-Y-monofosfat, omfattar 21 nukleotider (20 av dem är variabla) och är belägna mellan eller inuti intronerna av proteinkodande gener på mer än 5700 platser i två regioner av kromosom IV.

MiRNA spelar viktig roll med genuttryck under normala och patologiska tillstånd; hos människor finns det minst 450-500 sådana gener. Vanligtvis binder de till 3"-UTR-regionerna av mRNA (andra mål), kan de selektivt och kvantitativt (särskilt när man tar bort produkter av låguttryckta gener från cirkulationen) blockera arbetet hos vissa gener och aktiviteten hos andra gener. visade sig att uppsättningar av profiler av uttryckta mikro-RNA (och deras mål) förändras dynamiskt under ontogenes, cell- och vävnadsdifferentiering. antal synapser av en nervcell (med deltagande av miRNA-134, andra små RNA: er utveckling av många patologier (onkogenes, immunbrist, genetiska sjukdomar, parkinsonism, Alzheimers sjukdom, oftalmologiska störningar (retinoblastom, etc.)) associerade med infektioner. Det totala antalet upptäckta miRNA växer mycket snabbare än beskrivningen av deras reglerande roll och koppling till specifika mål.

Beräkningsanalys förutspår hundratals mRNA-mål för individuella miRNA och regleringen av individuella mRNA av flera miRNA. Således kan miRNA tjäna syftet att eliminera transkript av målgener eller finjustera deras uttryck på transkriptions-/translationsnivåerna. Teoretiska överväganden och experimentella resultat stöder förekomsten av olika roller för miRNA.

En mer komplett lista över aspekter relaterade till den grundläggande rollen för små RNA i eukaryoter i tillväxt-/utvecklingsprocesser och i vissa patologier (inklusive cancerepigenomik) återspeglas i granskningen.

Små RNA i onkologi

Processerna för tillväxt, utveckling, progression och metastasering av tumörer åtföljs av många epigenetiska förändringar som utvecklas till sällsynta, ihållande ärftliga genetiska förändringar. Sällsynta mutationer kan dock ha stor vikt (för en specifik individ, nosologi), eftersom i förhållande till enskilda gener (till exempel APC, K-ras, p53) den sk "tratt"-effekt förknippad med nästan irreversibel utveckling/konsekvenser av cancer. Den tumörspecifika heterogeniteten hos progenitorceller i termer av uttrycksprofilen för olika gener (proteiner, RNA, små RNA) bestäms av associerade variationer i omstrukturerade epigenomiska strukturer. Epigenomet moduleras genom metylering, posttranslationella modifieringar/ersättningar av histoner (med icke-kanoniska), ommodellering av den nukleosomala strukturen hos gener/kromatin (inklusive genomisk prägling, d.v.s. dysfunktion av uttrycket av alleler av föräldragener och X-kromosomer ). Allt detta, och med deltagande av RNAi som regleras av små RNA, leder till uppkomsten av defekta heterokromatiska (inklusive hypometylerade centromera) strukturer.

Bildandet av genspecifika mutationer kan föregås av den kända ackumuleringen av hundratusentals somatiska klonala mutationer i enkla upprepningar eller mikrosatelliter i en icke-kodande (sällan kodande) region - åtminstone i tumörer med en mikrosatellitmutatorfenotyp (MMP) ; de utgör en betydande del av kolorektal cancer, såväl som lungor, mage, endometrie etc. Instabila mono-/heteronu(poly-A6-10, liknande) finns många gånger oftare i regulatoriska icke-kodande gener som kontrollera uttrycket (introner, intergena) än i de kodande (exon) regionerna av genomet av mikrosatellit-instabila, MSI+, tumörer. Även om arten av utseendet och mekanismerna för lokalisering av MS-stabila/instabila regioner inte är helt klara, korrelerade bildandet av MS-instabilitet med frekvensen av mutationer av många gener som inte tidigare muterats i MSI+-tumörer och troligen kanaliserat vägarna för deras utveckling; Dessutom ökade frekvensen av MSI-repeterande mutationer i dessa tumörer med mer än två storleksordningar. Inte alla gener har analyserats med avseende på närvaron av upprepningar, men deras grad av mutabilitet i kodande/icke-kodande regioner är olika, och noggrannheten hos metoder för att bestämma mutationsfrekvensen är relativ. Det är viktigt att icke-kodande regioner av MSI-föränderliga upprepningar ofta är bialleliska, medan kodande regioner är monoalleliska.

En global minskning av metylering i tumörer är typisk för upprepningar, transposerbara element (TEs; deras transkription ökar), promotorer, CpG-ställen för tumörsuppressor miRNA-gener och korrelerar med hypertranskription av retrotransposoner i progressiva cancerceller. Normalt är fluktuationer i "metylomen" associerade med moder-/stadium-/vävnadsspecifika "metyleringsvågor" och stark metylering av centromera satellitregioner av heterokromatin, reglerade av små RNA. När satelliter är undermetylerade, åtföljs den resulterande kromosominstabiliteten av ökad rekombination, och störningar av ME-metylering kan utlösa deras uttryck. Dessa faktorer gynnar utvecklingen av en tumörfenotyp. Små RNA-terapi kan vara mycket specifik, men måste kontrolleras pga mål kan inte bara vara individuella utan också många mRNA/RNA-molekyler och nysyntetiserade RNA från olika (inklusive icke-kodande intergena upprepningar) regioner av kromosomer.

Det mesta av det mänskliga genomet består av upprepningar och ME. Retrotransposon L1 (LINE-element) innehåller, liksom endogena retrovirus, reverseas (RTas), endonukleas och är potentiellt kapabel att överföra icke-autonoma (Alu, SVA, etc.) retroelement; tystnad av L1/liknande element sker som ett resultat av metylering vid CpG-ställen. Observera att bland CpG-ställena i genomet är CpG-öarna av genpromotorer svagt metylerade, och 5-metylcytosin i sig är en potentiellt mutagen bas, deaminerad till tymin (kemiskt eller med deltagande av RNA/(DNA)-redigering, DNA reparera); dock är några av CpG-öarna föremål för överdriven avvikande metylering, åtföljd av undertryckande av suppressorgener och cancerutveckling. Vidare: det RNA-bindande proteinet som kodas av L1, som interagerar med proteinerna AGO2 (Argo-naute-familjen) och FMRP (bräckligt mental retardationsprotein, protein från effektorn RISC-komplexet), främjar rörelsen av L1-elementet - vilket indikerar en möjlig ömsesidig reglering av system-RNAi och retroposition av mänskliga LINE-element. Det är särskilt viktigt att Alu-repetitioner kan flytta in i intron/exonregionen av gener.

Dessa och liknande mekanismer kan förbättra den patologiska plasticiteten hos tumörcellgenomet. Undertryckande av RTas (som kodas, liksom endonukleas, av L1-element; RTas kodas också av endogena retrovirus) via RNAi-mekanismen åtföljdes av en minskning av proliferation och ökad differentiering i ett antal cancercellinjer. När L1-elementet infördes i en proto-onkogen eller suppressorgen observerades DNA-dubbelsträngsbrott. I könscellers vävnader (möss/människa) ökades expressionsnivån av L1, och dess metylering berodde på det piRNAs-(26-30-bp)-associerade tystnadssystemet, där PIWI-proteiner är varianter av den stora Argo-naute-proteinfamiljen , mutationer i vilka de leder till demetylering/derepression av L1/liknande element med långa terminala upprepningar. PIWI-proteiner, i större utsträckning än Dicer-1/2 och Ago-proteiner, är associerade med rasiRNAs tystande vägar. Tystnadsvägarna som förmedlas av piRNA/siRNA realiseras genom intranukleära kroppar som innehåller stora evolutionärt konserverade multiprotein PcG-komplex, vars funktioner ofta är försämrade i tumörceller. Dessa komplex är ansvariga för långväga verkan (över mer än 10 kb, mellan kromosomer) och reglerar klustret av HOX-gener som ansvarar för kroppsplanen.

Nya principer för antisensterapi kan utvecklas med hänsyn till kunskap om mer mycket specifika (än histonmodifierande hämmare av DNA/protein-metylering) antitumörepigenomiska medel, de grundläggande principerna för epigenomisk RNA-tystnad och små RNA:s roll i karcinogenesen.

Mikro-RNA i onkologi

Det är känt att ökad tumörtillväxt och metastasering kan åtföljas av en ökning av vissa och en minskning av uttrycket av andra individer/uppsättningar av miRNA (tabell 1). Vissa av dem kan ha en orsakande roll vid tumörbildning; och till och med samma miRNA (som miR-21/-24) i olika tumörceller kan uppvisa både onkogena och suppressiva egenskaper. Varje typ av mänsklig maligna tumör är tydligt särskiljbar genom sitt "miRNA-fingeravtryck", och vissa miRNA kan fungera som onkogener, tumörsuppressorer, initiatorer av cellmigration, invasion och metastaser. I patologiskt förändrade vävnader hittas ofta minskade mängder viktiga miRNA som sannolikt är involverade i anticancerförsvarssystem. De miRNA (miRs) som är involverade i onkogenes har bildat idén om den så kallade. "oncomirah": analys av uttrycket av mer än 200 miRNA i över 1000 prover av lymfom och solida cancerformer gjorde det möjligt att framgångsrikt klassificera tumörer i undertyper efter deras ursprung och differentieringsstadium. Funktionerna och rollen för miRNA har framgångsrikt studerats med: anti-miR-oligonukleotider modifierade (för att öka livslängden) vid 2"-O-metyl- och 2"-O-metoxietylgrupper; samt LNA-oligonukleotider, i vilka ribossyreatomerna i positionerna 2" och 4" är förbundna med en metylenbrygga.

(Bord 1)……………….

Tumör	miRNA
Lungcancer	17-92 , låt-7↓ , 124a↓ , 126 ↓ , 143 ↓ , 145 ↓ , 155 , 191 , 205 , 210
Bröstcancer	21 , 125b↓ , 145 ↓ , 155
Prostatacancer	15a ↓ , 16-1 ↓ , 21 , 143 ↓ ,145 ↓
Tarmcancer	19a , 21 , 143 ↓ , 145 ↓
Bukspottkörtelcancer	21 , 103 , 107 , 155 v
Äggstockscancer	210
Kronisk lymfatisk leukemi	15a ↓ , 16-1 ↓ , 16-2 , 23 b , 24-1 , 29 ↓ , 146 , 155 , 195 , 221 , 223 ↓

bord 1 .

miRNA vars uttryck ökar () eller minskar ( ↓ ) i några av de vanligaste tumörerna jämfört med normala vävnader (se, och även).

Man tror att den reglerande rollen för uttryck, försvinnande och amplifiering av miRNA-gener i predispositionen för initiering, tillväxt och progression av de flesta tumörer är signifikant, och mutationer i miRNA/mål-mRNA-par är synkroniserade. Expressionsprofilen för miRNA kan användas för klassificering, diagnos och klinisk prognos inom onkologi. Förändringar i uttrycket av miRNA kan påverka cellcykeln, cellens överlevnadsprogram. Mutationer av miRNA i stamceller och somatiska celler (liksom valet av polymorfa varianter av mRNA-mål) kan bidra till, eller till och med spela en avgörande roll i, tillväxten, progressionen och patofysiologin för många (om inte alla) maligniteter. Med hjälp av miRNA är korrigering av apoptos möjlig.

Förutom individuella miRNA upptäcktes kluster av dem, som fungerar som en onkogen som provocerar utvecklingen, i synnerhet, av hematopoetisk vävnadscancer hos experimentmöss; miRNA-gener med onkogena och suppressoregenskaper kan lokaliseras i samma kluster. Klusteranalys av miRNAs uttrycksprofiler i tumörer gör det möjligt att bestämma dess ursprung (epitel, hematopoetisk vävnad, etc.) och klassificera olika tumörer i samma vävnad med icke-identiska transformationsmekanismer. Bedömning av uttrycksprofilen för miRNA kan utföras med hjälp av nano-/mikroarrayer; Noggrannheten i en sådan klassificering, när man utvecklar tekniken (vilket inte är lätt), visar sig vara högre än att använda mRNA-profiler. Några av miRNA:erna är involverade i differentieringen av hematopoetiska celler (mus, människa), initiering av cancercellprogression. Humana miRNA-gener finns ofta i den sk. "bräckliga" platser, områden med en övervägande del av deletioner/insertioner, punktbrytningar, translokationer, transpositioner, minimalt utplånade och amplifierade regioner av heterokromatin involverade i onkogenes.

Angiogenes . Rollen för miRNA i angiogenes är sannolikt betydande. Ökad angiogenes i vissa Myc-aktiverade humana adenokarcinom åtföljdes av förändringar i uttrycksmönstret för vissa miRNA, och gennedbrytning av andra miRNA ledde till försvagning och undertryckande av tumörtillväxt. Tumörtillväxt åtföljdes av mutationer i K-ras-, Myc- och TP53-generna, ökad produktion av den angiogena VEGF-faktorn och graden av Myc-associerad vaskularisering; medan de antiangiogena faktorerna Tsp1 och CTGF undertrycktes av miR-17-92 och andra klusterassocierade miRNA. Tumörangiogenes och vaskularisering förbättrades (särskilt i kolonocyter) genom samuttryck av två onkogener snarare än en.

Neutralisering av den antiangiogena faktorn LATS2, en hämmare av animaliskt cyklinberoende kinas (CDK2; människa/mus), med miRNAs-372/373 ("potentiella onkogener") stimulerade testikeltumörtillväxt utan att skada p53-genen.

Potentiella modulatorer av angiogena egenskaper (in-vitro/in-vivo) är miR-221/222, vars mål, c-Kit-receptorer (andra), är faktorer för angiogenes av endotelvenösa HUVEC-celler i navelsträngen, etc. Dessa miRNA och c-Kit interagerar som en del av en komplex cykel som styr endotelcellers förmåga att bilda nya kapillärer.

Kronisk lymfatisk leukemi (KLL). Vid B-cells kronisk lymfatisk leukemi (KLL) noteras en reducerad nivå av genuttryck miR-15a/miR-16-1 (och andra) i 13q14-regionen av den mänskliga kromosomen - platsen för de vanligaste strukturella abnormiteterna ( inklusive deletioner av 30 kb-regionen), även om genomet uttryckte hundratals mänskliga mogna och pre-miRNA. Båda miRNA, potentiellt effektiva i tumörterapi, innehöll antisensregioner av det antiapoptotiska proteinet Bcl2, undertryckte dess överuttryck, stimulerade apoptos, men var nästan/helt frånvarande i två tredjedelar av de "avvikande" CLL-cellerna. Frekventa mutationer av sekvenserade miRNA i stamceller/somatiska celler identifierades hos 11 av 75 patienter (14,7%) med en familjär predisposition för KLL (arvssätt okänd), men inte hos 160 friska patienter. Dessa observationer ökar möjligheten för en direkt funktion av miRNA vid leukemogenes. För närvarande är inte allt känt om förhållandet mellan genuttrycksnivåerna för miRNA (och deras funktioner) och andra gener i normala/tumörceller.

Dokumentera

Relevans. Dysfunktion av ansiktsnerven under operation på öreskärlskottkörteln är en av de nuvarande problem och bestäms av både förekomsten av sjukdomen och den signifikanta frekvensen

Dawson Church - geniet ligger i dina gener epigenetisk medicin och den nya intentionernas biologi bok från biblioteket www e - pussel ru bok från biblioteket www e - pussel ru innehållsförteckning

bok

Etik andlighet onkologi hiv p garyaev* en enfi sammanfattning

Dokumentera

Den här artikeln speglar en ny titt på problemet med onkologi och HIV-infektion i ljuset av Linguistic-Wave Genetics (LWG) och Essence Coding Theory (ESC) baserad på ryska och andra sociokulturella realiteter.

Oncological Research Center och Blokhina Odintsova Anastasia Sergeevna nya kemoterapiregimer för avancerad och återkommande livmoderhalscancer 01/14/12 – onkologi

Avhandling

4.4. Bestämning av uriding(UGT1A1) i blodserumet hos patienter med livmoderhalscancer som fick första linjens kemoterapi med irinotekan med platinaderivat 105

Längden på siRNA är 21-25 bp, de bildas från dsRNA. Källan till sådana RNA kan vara virusinfektioner, genetiska konstruktioner som introduceras i genomet, långa hårnålar i transkript och dubbelriktad transkription av transposerbara element.
dsRNA skärs av Dicer RNase till fragment 21-25 bp långa. med 3" ändar som sticker ut med 2 nukleotider, varefter en av kedjorna är en del av RISC och styr skärningen av homologa RNA. RISC innehåller siRNA som motsvarar både plus- och minussträngar av dsRNA. siRNA har inte sina egna gener och representerar är fragment av längre RNA:er styr skärningen av mål-RNA:n, eftersom de är fullständigt komplementära till det. primers (primrar för syntesen av nytt RNA) Det resulterande dsRNA:t klipps av Dicer, nya siRNAs bildas, som är sekundära.

RNA-interferens

1998 publicerade Craig C. Mello och Andrew Fire i Nature, som antydde att dubbelsträngat RNA (dsRNA) kunde undertrycka genuttryck. Senare visade det sig att den aktiva principen i denna process är kort enkelsträngat RNA. Mekanismen för undertryckande av genuttryck med användning av dessa RNA kallas
RNA-interferens, såväl som RNA-tystnad. Denna mekanism finns i alla stora taxa av eukaryoter: ryggradsdjur och ryggradslösa djur, växter och svampar. 2006 fick han Nobelpriset för denna upptäckt.
Undertryckande av uttryck kan ske på transkriptionsnivå eller posttranskriptionellt. Det visade sig att i alla fall krävs en liknande uppsättning proteiner och korta (21-32 bp) RNA.
siRNA reglerar genaktivitet på två sätt. Som nämnts ovan styr de skärningen av mål-RNA. Detta fenomen kallas "undertryckning" ( dämpa) i svamp, " post-translationell gentystnad"i växter och" RNA-interferens "i djur. siRNA 21-23 bp långa är involverade i dessa processer. En annan typ av effekt är att siRNA kan undertrycka transkriptionen av gener som innehåller homologa siRNA-sekvenser. Detta fenomen kallades transkriptionell gentystnad (TGS) och finns i jäst, växter och djur. siRNA styr också DNA-metylering, vilket leder till heterokromatinbildning och transkriptionell repression. TGS studeras bäst i jästen S. pombe, där siRNA visar sig vara integrerade i ett RISC-liknande proteinkomplex som kallas RITS. I hans fall, som i fallet med RISC, interagerar siRNA med ett protein från AGO-familjen. Det är troligt att siRNA kan styra detta komplex till en gen som innehåller ett homologt siRNA-fragment. Efter detta rekryterar RITS-proteiner metyltransferaser, som ett resultat av vilka heterokromatin bildas i lokuset som kodar för siRNA-målgenen, och aktivt genuttryck upphör.

Roll i cellulära processer

Vilken betydelse har siRNA i en cell?
siRNA är involverade i cellskydd från virus, repression av transgener, reglering av vissa gener och bildning av centromerisk heterokromatin. En viktig funktion hos siRNA är undertryckande av uttrycket av mobila genetiska element. Sådan suppression kan ske både på transkriptionsnivå och posttranskriptionellt.
Genomet hos vissa virus består av DNA, medan andra består av RNA, och RNA hos virus kan vara antingen enkel- eller dubbelsträngat. Processen att skära främmande (viralt) mRNA i detta fall sker på samma sätt som beskrivits ovan, det vill säga genom att aktivera RISC-enzymkomplexet. Men för större effektivitet har växter och insekter uppfunnit ett unikt sätt att förstärka den skyddande effekten av siRNA. Genom att sammanfoga mRNA-strängen kan en sektion av siRNA, med hjälp av DICER-enzymkomplexet, först komplettera den andra strängen av mRNA och sedan klippa den på olika ställen och på så sätt skapa en mängd olika "sekundära" siRNA. De bildar i sin tur RISC och bär mRNA genom alla stadier som diskuterats ovan, tills dess fullständig destruktion. Sådana "sekundära" molekyler kommer specifikt att kunna binda inte bara till den del av det virala mRNA som den "primära" molekylen riktades till, utan också till andra områden, vilket dramatiskt ökar effektiviteten av cellulärt försvar.

I växter och lägre djurorganismer är således siRNA en viktig del av en sorts "intracellulär immunitet" som gör att de kan känna igen och snabbt förstöra främmande RNA. Om ett RNA som innehåller ett virus har kommit in i cellen kommer ett sådant skyddssystem att förhindra att det förökar sig. Om viruset innehåller DNA, kommer siRNA-systemet att förhindra att det producerar virala proteiner (eftersom det nödvändiga mRNA:t för detta kommer att kännas igen och skäras), och användning av denna strategi kommer att bromsa spridningen i hela kroppen.

Däggdjur har, till skillnad från insekter och växter, ett annat försvarssystem. När främmande RNA, vars längd är mer än 30 bp, kommer in i en "mogen" (differentierad) däggdjurscell, börjar cellen att syntetisera interferon. Interferon kan, genom att binda till specifika receptorer på cellytan, stimulera en hel grupp gener i cellen. Som ett resultat syntetiseras flera typer av enzymer i cellen, som hämmar proteinsyntesen och bryter ner viralt RNA. Dessutom kan interferon också verka på närliggande, ännu inte infekterade celler, och därigenom blockera eventuell spridning av viruset.

Som du kan se är båda systemen lika på många sätt: de har ett gemensamt mål och "metoder" för arbetet. Även namnen "interferon" och "(RNA) interferens" kommer själva från en gemensam rot. Men de har också en mycket betydande skillnad: om interferon, vid de första tecknen på invasion, helt enkelt "fryser" cellens arbete och inte tillåter (för säkerhets skull) produktionen av många, inklusive "oskyldiga" proteiner i cellen, då är siRNA-systemet extremt begripligt: Varje siRNA kommer att känna igen och förstöra endast sitt eget specifika mRNA. Ersättning av bara en nukleotid i siRNA leder till en kraftig minskning av interferenseffekten . Ingen av de hittills kända genblockerarna har en sådan exceptionell specificitet för sin målgen.

Upptäckten av RNA-interferens har gett nytt hopp i kampen mot AIDS och cancer. Det är möjligt att genom att använda siRNA-terapi tillsammans med traditionell antiviral terapi kan en potentieringseffekt uppnås, där de två behandlingarna resulterar i en större terapeutisk effekt än den enkla summan av varje given separat.
För att kunna använda siRNA-interferensmekanismen i däggdjursceller måste färdiga dubbelsträngade siRNA-molekyler införas i cellerna. Den optimala storleken på sådant syntetiskt siRNA är samma 21-28 nukleotider. Om du ökar dess längd kommer cellerna att svara genom att producera interferon och minska proteinsyntesen. Syntetiska siRNA kan komma in i både infekterade och friska celler, och en minskning av proteinproduktionen i oinfekterade celler skulle vara mycket oönskad. Å andra sidan, om du försöker använda siRNA mindre än 21 nukleotider, minskar specificiteten för dess bindning till önskat mRNA och förmågan att bilda RISC-komplexet kraftigt.

Om det är möjligt att leverera siRNA på ett eller annat sätt som har förmågan att binda till någon del av HIV-genomet (som som bekant består av RNA) kan man försöka förhindra dess integration i värdens DNA cell. Dessutom utvecklar forskare sätt att påverka olika stadier av HIV-reproduktion i en redan infekterad cell. Det senare tillvägagångssättet kommer inte att ge ett botemedel, men det kan avsevärt minska hastigheten på virusreproduktionen och ge det krökta immunsystemet en chans att "vila" från den virala attacken och försöka hantera resterna av själva sjukdomen. I figuren är de två stadierna av HIV-reproduktion i en cell, som forskarna hoppas kan blockeras med siRNA, markerade med röda kors (stadier 4-5 - integrering av viruset i kromosomen och steg 5-6 - montering av viruset och lämnar cellen).

Idag hänför sig dock allt ovanstående endast till teoriområdet. I praktiken stöter siRNA-terapi på svårigheter som forskarna ännu inte har kunnat övervinna. Till exempel, när det gäller antiviral terapi, är det den höga specificiteten hos siRNA som kan spela ett grymt skämt: virus har som bekant förmågan att snabbt mutera, d.v.s. ändra sammansättningen av dess nukleotider. Hiv har varit särskilt framgångsrik i detta, där förändringsfrekvensen är sådan att en person som är infekterad med en subtyp av viruset efter några år kan utveckla en helt annan subtyp. I detta fall kommer den modifierade HIV-stammen automatiskt att bli okänslig för det siRNA som valdes i början av behandlingen.

Åldrande och karcinogenes

Liksom alla epigenetiska faktorer påverkar siRNA uttrycket av gener som tystas. Nu finns det verk som beskriver experiment med att stänga av gener förknippade med tumörer. Gener stängs av (knock-down) med siRNA. Till exempel använde kinesiska forskare siRNA för att stänga av genen för transkriptionsfaktor 4 (TCF4), vars aktivitet orsakar Pitt-Hopkins syndrom (en mycket sällsynt genetisk sjukdom som kännetecknas av mental retardation och episoder av hyperventilation och apné) och andra psykiska sjukdomar. I detta arbete studerade vi rollen av TCF4 i magcancerceller. Ektopiskt uttryck av TCF4 minskar celltillväxten i magcancercellinjer, att slå ut TCF4-genen med hjälp av siRNA ökar cellmigration. Således kan vi dra slutsatsen att epigenetisk avstängning (tystnad) av TCF4-genen spelar en viktig roll i bildandet och utvecklingen av tumörer.

Enligt forskning vid avdelningen för onkologi, Albert Einstein Cancer Center, ledd av Leonard H. Augenlicht, är siRNA involverat i att stänga av HDAC4-genen, som orsakar hämning av tjocktarmscancertillväxt, apoptos och ökad transkription av p21. HDAC4 är ett histondeacetylas som är vävnadsspecifikt, hämmar celldifferentiering och dess uttryck undertrycks under celldifferentieringsprocessen. Arbetet visar att HDAC4 är en viktig regulator av koloncellsproliferation (vilket är viktigt i cancerprocessen), och det i sin tur regleras av siRNA.

Institutionen för patologi, Nara Medical University School of Medicine i Japan forskar om prostatacancer. Replikativt åldrande av celler är en barriär mot okontrollerad delning och karcinogenes. Kortlivade delande celler (TAC) är en del av prostatacellpopulationen från vilken tumörer bildas. Japanska forskare studerade orsakerna till att dessa celler övervinner åldrandet. Prostataceller i kultur transfekterades med junB siRNA. Dessa celler uppvisar ökade uttrycksnivåer av p53, p21, p16 och pRb, som detekteras under åldrande. Celler i kultur som visade reducerade nivåer av p16 användes för nästa steg. Upprepad siRNA-transfektion till TAC tillät celler att undvika åldrande vid p16/pRb-inaktivering. Dessutom orsakar tystnad av junB-proto-onkogenen av junB siRNA cellinvasion. Baserat på detta drogs slutsatsen att junB är ett element för p16 och främjar cellulär senescens, vilket förhindrar TAC-malignitet. Således är junB en regulator av prostatacancer och kan vara ett mål för terapeutisk intervention. Och dess aktivitet kan regleras med siRNA.

Det pågår en hel del liknande studier. För närvarande är siRNA inte bara ett objekt, utan också ett verktyg i händerna på en forskare - läkare, biolog, onkolog, gerontolog. Att studera sambandet mellan siRNA och cancer och uttrycket av åldersrelaterade gener är den viktigaste uppgiften för vetenskapen. Mycket kort tid har gått sedan upptäckten av siRNA, men många intressanta studier och publikationer relaterade till dem har dykt upp. Det råder ingen tvekan om att deras studie kommer att vara ett av mänsklighetens steg mot seger över cancer och åldrande...