(Активатори - підвищують, інгібітори - знижують) Білкові ферменти синтезуються на рибосомах, а РНК - в ядрі.
Терміни «фермент» та «ензим» давно використовують як синоніми (перший в основному в російській та німецькій науковій літературі, другий - в англо- та франкомовній).
Наука про ферменти називається ензимологією, а не ферментологією (щоб не змішувати коріння слів латинської та грецької мов).
Історія вивчення
Термін ферментзапропонований у XVII столітті хіміком ван Гельмонтом під час обговорення механізмів травлення.
У кін. ХVІІІ – поч. ХІХ ст. вже було відомо, що м'ясо перетравлюється шлунковим соком, а крохмаль перетворюється на цукор під дією слини. Проте механізм цих явищ був невідомий
Ферменти широко використовуються в народному господарстві- харчової, текстильної промисловості, у фармакології.
Класифікація ферментів
За типом каталізованих реакцій ферменти поділяються на 6 класів згідно з ієрархічною класифікацією ферментів (КФ - Enzyme Comission code). Класифікацію було запропоновано Міжнародним союзом біохімії та молекулярної біології (International Union of Biochemistry and Molecular Biology). Кожен клас містить підкласи, тому фермент описується сукупністю чотирьох чисел, розділених крапками. Наприклад, пепсин має назву ЄС 3.4.23.1. Перше число грубо описує механізм реакції, що каталізується ферментом:
- КФ 1: Оксидоредуктази, що каталізують окиснення або відновлення. Приклад: каталаза, алкогольдегідрогеназа
- КФ 2: Трансферази, що каталізують перенесення хімічних груп з однієї молекули субстрату на іншу Серед трансфераз особливо виділяють кінази, що переносять фосфатну групу, як правило, з молекули АТФ.
- КФ 3: Гідролази, що каталізують гідроліз хімічних зв'язків. Приклад: естерази, пепсин, трипсин, амілаза, ліпопротеїнліпаза
- КФ 4: Ліазикаталізують розрив хімічних зв'язків без гідролізу з утворенням подвійного зв'язку в одному з продуктів.
- КФ 5: Ізомерази, що каталізують структурні або геометричні зміни в молекулі субстрату
- КФ 6: Лігази, що каталізують утворення хімічних зв'язків між субстратами за рахунок гідролізу АТФ Приклад: ДНК-полімераза
Кінетичні дослідження
Крива насичення хімічної реакції, що ілюструє співвідношення між концентрацією субстрату [S] та швидкістю реакції v
Найпростішим описом кінетики односубстратних ферментативних реакцій є рівняння Міхаеліса – Ментен (див. рис.). Сьогодні описано кілька механізмів дії ферментів. Наприклад, дія багатьох ферментів описується схемою механізму пінг-понг.
Структура та механізм дії ферментів
Активність ферментів визначається їхньою тривимірною структурою.
Як і всі білки, ферменти синтезуються у вигляді лінійного ланцюжка амінокислот, яка згортається певним чином. Кожна послідовність амінокислот згортається особливим чином, і виходить молекула (білкова глобула) має унікальні властивості. Декілька білкових ланцюгів можуть об'єднуватися в білковий комплекс. Третинна структура білків руйнується при нагріванні чи дії деяких хімічних речовин.
Щоб каталізувати реакцію, фермент має зв'язатися з одним чи кількома субстратами. Білковий ланцюг ферменту згортається таким чином, що на поверхні глобули утворюється щілина або западина, де зв'язуються субстрати. Ця область називається сайтом зв'язування субстрату. Зазвичай він збігається з активним центром ферменту або знаходиться поблизу нього. Деякі ферменти містять сайти зв'язування кофакторів або іонів металів.
У деяких ферментів є сайти зв'язування малих молекул, вони можуть бути субстратами або продуктами метаболічного шляху, до якого входить фермент. Вони зменшують або збільшують активність ферменту, що створює можливість зворотного зв'язку.
Для активних центрів деяких ферментів характерне явище кооперативності.
Специфіка
Ферменти зазвичай виявляють високу специфічність стосовно своїх субстратів. Це досягається частковою комплементарністю форми, розподілу зарядів та гідрофобних областей на молекулі субстрату та у центрі зв'язування субстрату на ферменті. Ферменти демонструють високий рівеньстереоспецифічності, регіоселективності та хемоселективності.
Модель «ключ-замок»
Гіпотеза Кошланда про індуковану відповідність
Більш реалістична ситуація у разі індукованої відповідності. Неправильні субстрати – надто великі чи надто маленькі – не підходять до активного центру
У 1890 р. Еміль Фішер припустив, що специфічність ферментів визначається точною відповідністю форми ферменту та субстрату. Таке припущення називається моделлю "ключ-замок". Фермент з'єднується з субстратом з утворенням короткоживучого фермент-субстратного комплексу. Проте, хоча ця модель пояснює високу специфічність ферментів, вона пояснює явища стабілізації перехідного стану, що спостерігається практично.
Модель індукованої відповідності
У 1958 р. Деніел Кошланд запропонував модифікацію моделі «ключ-замок». Ферменти, переважно, - не жорсткі, а гнучкі молекули. Активний центр ферменту може змінити конформацію після зв'язування субстату. Бічні групи амінокислот активного центру приймають таке положення, що дозволяє ферменту виконати свою функцію каталітичну. У деяких випадках молекула субстрату змінює конформацію після зв'язування в активному центрі. На відміну від моделі «ключ-замок», модель індукованої відповідності пояснює як специфічність ферментів, а й стабілізацію перехідного стану.
Модифікації
Багато ферментів після синтезу білкового ланцюга зазнають модифікації, без яких фермент не виявляє своєї активності повною мірою. Такі модифікації називаються посттрансляційними модифікаціями (процесингом). Один із найпоширеніших типів модифікації - приєднання хімічних груп до бічних залишків поліпептидного ланцюга. Наприклад, приєднання залишку фосфорної кислоти називається фосфорилюванням, воно каталізується ферментом кіназою. Багато ферментів еукаріотів глікозильовані, тобто модифіковані олігомерами вуглеводної природи.
Ще один поширений тип посттранляційних модифікацій – розщеплення поліпептидного ланцюга. Наприклад, хімотрипсин (протеаза, що бере участь у травленні), виходить при вищепленні поліпептидної ділянки з хімотрипсиногену. Хімотрипсиноген є неактивним попередником хімотрипсину і синтезується в підшлунковій залозі. Неактивна форма транспортується на шлунок, де перетворюється на хімотрипсин. Такий механізм необхідний для того, щоб уникнути розщеплення підшлункової залози та інших тканин до надходження ферменту до шлунка. Неактивний попередник ферменту називають також "зимогеном".
Кофактори ферментів
Деякі ферменти виконують каталітичну функцію власними силами, без будь-яких додаткових компонентів. Однак є ферменти, яким для здійснення каталізу необхідні компоненти небілкової природи. Кофактори можуть бути як неорганічними молекулами (іони металів, залізо-сірчані кластери та ін), так і органічними (наприклад,
Метаболізм- сукупність, що підтримує життя хімічних реакційорганізму. Згадавши про мільярди реакцій, що постійно відбуваються, можна здивуватися, як у нас залишаються сили на щось ще. А оскільки одна з головних цілей метаболізму – забезпечення організму готової до використання енергією, дуже важливо, щоб її вироблення перевищувало – і набагато – витрати на виробництво. На щастя, під час еволюції ми отримали молекули, основним завданням яких стало зменшення енерговитрат, необхідні хімічних реакцій в організмі. Їх називають ферментами.
Це великі білкові молекули, присутні у всіх наших клітинах і шляхом серії реакцій перетворюють одне (скажімо, молекулу цукру), що називається субстратом, в інше (наприклад, пов'язана з глюкозою речовина, з якої організм синтезує жири) - продукт або метаболіт. Уявіть собі ферменти як великі автоматизовані фабрики: з одного боку величезної будівлі ви подаєте колоду (субстрат), а на виході отримуєте гарну салатницю (продукт). Звичайно, можна зробити її вручну, але на це піде набагато більше сил та часу; Фабрика сильно підвищує ефективність.
Ферментироблять те ж усередині клітини, швидко перетворюючи субстрати на продукти та споживаючи при цьому дуже мало енергії. Реакції, що вони викликають (біологи використовують слово «каталізують»), рідко чи зовсім відбуваються без допомоги ферментів. Якщо це трапляється, швидкість реакції становить крихітну частку можливої за участю ферменту, а витрати енергії набагато вищі.
Відносні розміри ферментів дуже великі. Їхні молекули можуть бути в 10–20 тис. разів більшими за молекули субстрату, який вони обробляють. І справді схоже на фабрику та поліно. На рис. 7.4 показаний субстрат А, що перетворюється на продукт Б. Однак більшість реакцій не відбувається ізольовано: вони пов'язані з наступними, де Б (тепер уже субстрат) перетворюється на В (новий продукт). Фермент 1 перетворює А на Б, а фермент 2 - Б на В.
Мал. 7.4. Проста ферментативна реакція
Ферменти можуть працювати з різною силою залежно від запасів (кількості субстрату) та потреб (кількості наявного в клітині продукту). Як конвеєр, який рухається швидше або повільніше залежно від постачання сировини та попиту на готову продукцію, ферменти змінюють швидкість перетворення субстратів (професійною мовою - «активність»). Вони можуть каталізувати навіть зворотні реакції, перетворюючи продукт на субстрат. Загалом, від ферментів залежить, чи відбудеться реакція, а якщо так, то як швидко і в якому напрямі.
Ферментативна активність та форма ферменту
Початкова форма ферментівнагадує ланцюжок амінокислот, розташованих у послідовності, яка закодована в ДНК. Але, оскільки амінокислоти мають хімічну та фізичну спорідненість, ланцюжок складається і утворює тривимірну форму, як дуже довга нитка намагнічених намистин (рис. 7.5).
Мал. 7.5. Комп'ютерна модель ферменту цАДФ-рибози-гідролази (CD38)
Один із способів коригування ферментативної активності- Зміна форми ферменту. Це має серйозні наслідки, тому що змінює його хімічні та фізичні властивості, а також здатність модифікувати швидкість реакції. Багато вчених-ензимологів поетизують швидкість, з якою ферменти змінюють конфігурацію до виконання своїх завдань. Ось показова стаття з New World Encyclopedia (http://www.newworldencyclopedia.org):
Щоб фермент був функціональний, він має набути тривимірної форми. Як відбувається цей складний процес залишається загадкою. Невеликий ланцюжок із 150 амінокислот утворює фермент, що має неймовірну кількість можливих конфігурацій: якщо перевіряти по 1012 різних конфігурацій за секунду, потрібно 1026 років, щоб знайти вірну...
Але фермент, що денатурував, може правильно скластися за частку секунди, а потім брати участь у хімічних реакціях… Це показує приголомшливу складність і гармонію Всесвіту.
Намагаючись описати невимовне, автор наводить приклад порівняно невеликий (для ферменту) гіпотетичної молекули. Швидкість складання ферменту з лінійного ланцюжка у готову до роботи сферу феноменальна. Не менш приголомшує хімічну різноманітність субстратів, які можуть метаболізувати один активний фермент. І так само вражає безліч факторів, здатних модифікувати структуру ферментів, їх кількість і активність.
Все це показує глибоку зв'язок між метаболізмом поживних речовин та світом ферментів. Каталізовані ними реакції, нескінченні числом і нескінченно переплетені, контролюються нутрієнтами та зв'язаними сполуками, число яких також нескінченно.
Дослідження щодо визначення ферментативної активності МКД на основі різних бактерій проводилися в чотири етапи. Для дослідження було відібрано зразки МКД на основі монокультур МКД-В (Bifidobacter bifidum longum),МКД-S ( Streptococcus termophilus), МКД-P (Propionobacterium acidi-propionicum),МКД-L (Lactobacillus acidophilus).
Мета досліджень - визначення здатності пробіотичних мікроорганізмів, що входять до складу МКД, синтезувати ферменти.
На першому етапіза ГОСТ 20264.4-89 Препарати ферментні. Метод визначення амілолітичної активності у всіх зразках МКД методом Айсона визначалася сумарна амілолітична активність. Метод Ансона ґрунтується на гідролізі крохмалю ферментно-амілолітичним комплексом до декстринів різної молекулярної маси.
На другому етапіза ГОСТ 20264.2-88 Препарати ферментні. Методи визначення протеолітичної активності» визначалася сумарна протеолітична активність (ПА) у досліджуваних зразках. Метод заснований на гідролізі білка натрію казеїнату ферментним комплексом при pH-7,2. Для визначення ПА нейтральної протеази 0-10 од/мл перевірено мінімальні розведення. Кисла протеаза визначалася при pH-5,5, за якої проходить гідроліз білка.
На третьому етапіза ТУ9291-008-13684916-05 у всіх представлених зразках МКД визначалася загальна целюлозолітична активність (ЦА). Методика визначення целюлази заснована на визначенні цукрів, що відновлюють, в результаті гідролізу целюлази хроматографічного паперу під дією ферменту. Метод рекомендований міжнародною комісією ІЮПАК з біотехнології як основний тест на целюлазну активність. За одиницю ефективності целюлази приймають таку кількість ферменту, яке при дії на хроматографічний папір при 50°С і pH 4,8 утворює 1 ммоль цукрів, що відновлюють, в 1 хв. Як правило, активність виявляється у одиницях на мілілітр.
Останнім, четвертим етапомбуло визначення активності ліпази (ЛА). Метод визначення ліпази за методикою Скермана заснований на титруванні лугом жирних кислот, що утворилися під дією ліпази, при використанні субстрату оливкової олії. При визначенні ліпази використовувалася реакційна суміш, що складається з 6,5 мл 1/15 М фосфатно-цитратного буфера, 2,5 мл емульсії оливкової олії в 1% розчині полівінілового спирту у співвідношенні 2:3 і 1 мл фільтрату культуральної рідини .
Дослідження МКД на основі різних мікроорганізмів-пробіотиків показали, що всі МКД, що досліджуються, містять одну або кілька груп ферментів (табл. 8). Так, МКД-В показала наявність всіх досліджуваних груп ферментів. МКД-Р містить у своєму складі три групи ферментів: амілолітичні, протеолітичні, целюлозолітичні. У МКД-L виявлено також три групи ферментів: протеолітичні, целюлозолітичні та ліполітичні, слабо виражена амілолітична група. МКД-S має у своєму складі дві групи ферментів: протеолітичну та целюлозолітичну, амілолітичну та ліполітичну активність виражені слабо.
Таблиця 8
Ферментативна активність МКД, од/мл
Аналізуючи дані, отримані в результаті дослідження ферментативної активності МКД, можна відзначити, що всі МКД, що досліджуються, мають високий ступіньактивності целюлази – від 64,46 (МКД-Р) до 72,4 од/мл (МКД-L).
МКД-S та МКД-В мають однакову активність целюлази - 66,7 од/мл.
Всі досліджувані МКД містять кислу протеазу, в якій гідроліз білка здійснюється при pH-5,5. Найбільша активністьпротеази виявлено в МКД-Р - 7,5 од/мл, найменша - у МКД-L (1,0 од/мл). МКД-В має значення активності протеази 2,0, МКД-S – 2,5 од/мл.
Активність ліпази визначена в МКД-L - 1,4 та в МКД-В - 12,6 од/мл. У МКД-S та МКД-Р фермент ліпазу не виявлений.
Амілолітична активність виявлена в МКД-В - 11,2 та в МКД-Р - 9,4 од/мл.
На рис. 1^1 графічно представлені значення ферментативної активності МКД.
Мал. 1.
Мал. 2.
Мал. 3.
Мал. 4.
Результати дослідження ферментативної активності МКД на основі різних бактерій узгоджуються з літературними даними про те, що бактерії-пробіонти мають ферментативну активність. Наші дослідження виявили провідні ферментні властивості біфідобактерій у складі МКД у порівнянні з іншими досліджуваними мікроорганізмами. Різні штами біфідобактерій становлять, за деякими даними, до 90% представників нормофлори кишківника птиці. Біфідобактерії знаходяться у всіх відділах кишечника.
Синтезовані ними ферментні групи беруть участь у всіх ферментних процесах при перетворенні поживних речовин корми у шлунково-кишковому тракті. На думку А. І. Хавкіна (2003), біфідобактерії беруть активну участь у процесах ензиматичного перетворення кормів, посилюючи гідроліз протеїнів, зброджують вуглеводи, омиляють жири, розчиняють клітковину Усі досліджувані нами бактерії у складі МКД показали певний ступінь ферменту. Отримані дані свідчать про специфічність рівня та спектру вироблених ферментних груп залежно від належності мікроорганізмів до певних видів та умов життєдіяльності. Ці дані, разом із іншими характеристиками, повинні враховуватися під час розробки різних рекомендаційщодо застосування тих чи інших видів пробіотичних кормових добавок.
Ферменти – біологічні каталізатори, високомолекулярні речовини білкової природи, що виробляються живою клітиною. Вони суворо специфічні і грають найважливішу роль обміні речовин мікроорганізмів. Специфічність їх пов'язана з активними центрами, утвореними групою амінокислот, тобто кожен фермент реагує з певною хімічною сполукою або каталізує одну або кілька хімічних близьких реакцій. Наприклад: фермент лактаза розщеплює лактозу, мальтазу - мальтозу і т.д.
Екзоферменти - виділяючись у зовнішню ере- Ендоферменти - участ-ду, розщеплюють макромолекули поживних затишок в реакціях обміну речовин до більш простих сполук, які можуть бути засвоєні мікробною клітиною (екзоферменти гідролізу викликають гідроліз жирів, білків, вуглеводів).
Ферментний склад мікроорганізмів є незмінним, а різні види бактерій чітко різняться за набором ферментів. Тому вивчення ферментативного складу має значення для ідентифікації різних мікроорганізмів.
Практичне використання ферментативних властивостей мікробів: процеси бродіння, гриби в пивоварстві та виноробстві, обробка шкур для пом'якшення; Консервування. Приготування біодобавок до пральних порошків для видалення білкових забруднень, оскільки вони розщеплюють білки до водорозчинних.
За допомогою ферментів одержують вітаміни, гормони, алкалози.
речовин, що відбуваються усередині клітини.
ПОДИВИТИСЯ ЩЕ:
УЖиттєдіяльності бактерій ферменти відіграють важливу роль, оскільки є обов'язковими учасниками різноманітних біохімічних реакцій, що лежать в основі функцій живлення, дихання, розмноження.
Стійкість ферментативних систем бактерій дозволяє використовувати їх біохімічні властивості у поєднанні з морфологічними та культуральними ознаками для визначення видів мікроорганізмів.
Для виявлення ферментів використовують лише чисті культури мікроорганізмів, які засівають на спеціальні диференційно-діагностичні середовища. Переважне значення для дослідження біохімічної активності бактерій мають сахаролитические, протеолитические і окислювально-відновні ферменти.
Сахаралітичні ферменти бактерій.Сахаролітична активність мікроорганізмів визначається ферментативному розщепленню багатоатомних спиртів і вуглеводів при посіві їх на диференціально-діагностичні середовища. Різні види мікробів при оптимальних умовах по-різному відносяться до тих самих цукрів, розщеплюючи одні і залишаючись нейтральними по відношенню до інших. Це властивість мікробів використовується в бактеріологічній практиці для диференціації різних видів та різновидів бактерій.
На щільних, рідких і напіврідких живильних середовищах, що містять різні індикатори (найчастіше індикатор Андреде), цукри під дією сахаролітичних ферментів бактерій розщеплюються на альдегіди та кислоти. Кінцевими продуктами їхнього розщеплення є вуглекислий газ і водень. Накопичення кислот знижує рН живильного середовища, що призводить до зміни кольору індикатора і середовища. Якщо бактерії не виділяють фермент до цього вуглеводу, то колір індикатора та живильного середовища не змінюється. Тому набір живильних середовищ з індикаторами називають строкатим чи кольоровим рядом.
Для виявлення сахаролітичних ферментів досліджувану культуру бактерій найчастіше засівають у кольорові середовища («строкатий ряд») гісса (рец. 15) з вуглеводами та індикатором Андреде (рец. 16) або індикатором ВР (суміш водного блакитного з розоловою кислотою). «Строкатий ряд» Гісса містить зазвичай п'ять пробірок; з глюкозою, лактозою, манітом, мальтозою та сахарозою. У деяких випадках для більш поглибленого вивчення біохімічних властивостей мікроорганізмів «строкатий ряд» гісса доповнюють дульцитом, сорбітом, ксилозою, арабінозою. Цукор, що застосовується для виявлення сахаролітичних ферментів, повинен бути хімічно чистим.
Середовища Гісса бувають рідкі та напіврідкі (з додаванням 0,5% агар-агару). У пробірки з рідкими живильними середовищами опускають бродильну трубочку (поплавець), яка є скляною трубочкою, запаяною з одного кінця. При стерилізації поплавок повністю заповнюється живильним середовищем. При утворенні серед газоподібних продуктів вони витісняють рідина з поплавця з утворенням повітряного дзвону. У напіврідких середовищах газоутворення визначають наявність бульбашок в товщі середовища.
Протеолітичні ферменти бактерій. Деякі мікроорганізми продукують та виділяють у зовнішнє середовище протеолітичні ферменти, що каталізують розщеплення білків. Внаслідок розщеплення молекули білка утворюються високомолекулярні проміжні продукти розпаду — пептони, амінокислоти та поліпептиди.
Для виявлення протеолітичних ферментів досліджувану культуру мікроорганізмів засівають у живильне середовище, що містить той чи інший білок. Найчастіше для цієї мети застосовують желатину, рідше згорнуту кінську сироватку, коагульований яєчний білок, молоко або шматочки вареного м'яса.
Для визначення протеолітичної активності мікроорганізмів на желатині готують м'ясо-пептонну желатину (рец. 17) та розливають у пробірки стовпчиком по 5-6 мл. Після застигання живильного середовища проводять посів уколом, занурюючи петлю в глибину живильного середовища до дна пробірки.
Мікроби, здатні рости за низької температури, інкубують при 20°С-22°С. Інші посіви інкубують при 37°С. При температурі 37°С желатину плавиться, тому після інкубації витягнуті пробірки поміщають у холодильник або холодну воду для застигання середовища. Після застигання середовища розпочинають перегляд результатів зростання мікроорганізмів. При виділенні протеолітичного ферменту желатинази відбувається розщеплення білків і спостерігається розрідження живильного середовища з малюнком, характерним для певних видів мікроорганізмів (рис. 37). Наприклад, сибірка паличка розріджує желатину желатину у вигляді воронки, стафілококи - у вигляді панчохи, синьогнійна паличка - пошарово і т.д.
ФЕРМЕНТАТИВНА АКТИВНІСТЬ МІКРООРГАНІЗМІВ
Різні форми розрідження желатини мікроорганізмами
Визначення протеолітичної активності бактерій на молочному агарі Ейкмана.Готують молочний агар Ейкмана, для чого до 10 мл стерильного розплавленого живильного агару додають 3 мл знежиреного молока та змішують. Молочний агар Ейкмана (рец. 18) розливають у чашки Петрі і після остигання засівають досліджуваним мікроорганізмом петлею штрихами або шпателем, щоб отримати ізольовані колонії. Через 24-48 годин інкубації в термостаті культури, що продукують протеолітичні ферменти, розкладають молочний білок - казеїн, у результаті навколо колоній утворюються чіткі прозорі зони на тлі каламутного живильного середовища.
Дата публікації: 2015-11-01; Прочитано: 1165 | Порушення авторського права сторінки
studopedia.org - Студопедія. Орг - 2014-2018 рік. (0.001 с) ...
Лекція № 3. Хімічна структура, біохімічні властивості та ферменти бактерій.
Клітина – універсальна одиниця живої матерії. За хімічним складом суттєвих відмінностей прокаріотичних та еукаріотичних клітин немає.
Хімічні елементи, що входять до складу живої матерії, можна поділити на три основні групи.
1.Біогенніхімічні елементи (З, N, H). На частку припадає 95% сухого залишку, зокрема. 50% - C, 20% - O, 15% - N, 10% - H).
2.Макроелементи- P, S, Cl, K, Mg, Ca, Na. Там припадає близько 5 %.
3.Мікроелементи- Fe, Cu, I, Co, Mo та ін На них припадають частки відсотка, проте вони мають важливе значення в обмінних процесах.
Хімічні елементи входять до складу різних речовин води, білків, ліпідів, нейтральних жирів, вуглеводів, нуклеїнових кислот. Синтез сполук контролюється генами. Багато речовин бактеріальна клітина може одержувати ззовні - з навколишнього середовища чи організму господаря.
Водастановить від 70 до 90% біомаси. Вміст води більше у капсульних бактерій, найменше-у суперечках.
Білкизустрічаються у всіх структурних елементахклітини. Білки можуть бути простіші (протеїни) і складніші (протеїди), у чистому вигляді або в комплексі з ліпідами, цукрами. Виділяють структурні (структуроутворюючі) та функціональні (регуляторні) білки, до останніх відносяться ферменти.
До складу білківвходять як звичайні для еукаріотів амінокислоти, так і оригінальні діамінопімелінова, D-аланін, D-глютанін,входять до складу пептидогліканів і капсул деяких бактерій. Тільки у суперечках знаходиться дипіколінової кислоти, З якою пов'язана висока резистентність суперечка. Джгутики побудовані з білка флагеліна, Що володіє скорочувальною здатністю та вираженими антигенними властивостями. Пили (ворсинки) містять особливий білок. пілін.
Пептидну природу мають капсули представників роду Bacillus, збудника чуми, поверхневі антигени ряду бактерій, у тому числі стафілококів та стрептококів. Білок А- Специфічний білок S.aureus - фактор, що обумовлює ряд властивостей цього збудника. Білок М- Специфічний білок гемолітичних стрептококів серогрупи А, що дозволяє диференціювати серовари (близько 100), що має епідеміологічне значення.
Ряд білків містить зовнішню мембрану грамнегативних бактерій, з яких 3 - 4 мажорних(Основних) і більше 10 - другорядних, що виконують різні функції. Серед мажорних білків- поріни, що утворюють дифузні пори, через які в клітину можуть проникати дрібні гідрофільні молекули
Білки входять до складу пептидоглікану- Біополімери, що становить основу бактеріальної клітинної стінки. Він складається з кістяка (що чергуються молекули двох аміносахарів) і двох наборів пептидних ланцюжків - бічних і поперечних. Наявність двох типів зв'язків — глікозидних (між аміносахарами) та пептидних, які з'єднують субодиниці пептидогліканів, надають цьому гетерополімеру структуру молекулярної мережі. Пептидоглікан - найбільш стійка сполука, яка утворює ригідну мішкоподібну макромолекулу, що визначає постійну форму бактерій і ряд їх властивостей..
1.Пептидоглікан містить родо- і видоспецифічні антигенні детермінанти.
2.Він запускає класичний та альтернативний шляхи активації системи комплементу.
3.Пептидоглікан гальмує фагоцитарну активність та міграцію макрофагів.
4.Він здатний ініціювати розвиток гіперчутливості уповільненого типу (ГЗТ).
5.Пептидоглікан має протипухлинну дію.
6.Вон надає пирогенное дію, тобто. викликає лихоманку.
Зі сполук білків з небілковими компонентами найбільше значеннямають ліпопротеїди, глікопротеїди та нуклеопротеїди.
Дивовижне таїнство життя - синтез білка здійснюється в рибосомах. Існує два основних типи рибосом - 70S (S-константа седиментації, одиниця Сведберга) та 80S. Рибосоми першого типу зустрічаються лише у прокаріотів. Антибіотики не діють на синтез білка у рибосомах типу 80S, поширених у еукаріотів.
Ліпіди(головним чином форфоліпіди) містяться в цитоплазматичної мембрані (ліпідний бішар), також у зовнішній мембрані грамнегативних бактерій. Є мікроорганізми, що містять велику кількість ліпідів (до 40% сухого залишку) – мікобактерії. До складу ліпідів входять різні жирні кислоти, дуже специфічні для різних групмікроорганізмів. Їх визначення має у ряді випадків діагностичне значення, наприклад, у анаеробів, мікобактерій.
У мікобактерій туберкульозу у складі ліпідів є ряд кислотостійких жирних кислот. фтіонова, миколевата ін Високий вміст ліпідів та їх склад визначають багато властивостей мікобактерій туберкульозу:
Стійкість до кислот, лугів та спиртів;
Важка офарблюваність барвниками (використовують спеціальні методи забарвлення, частіше за Цилю-Нільсеном);
Стійкість збудника до сонячної радіації та дезозасобів;
- Патогенність.
Тейхоєві кислотизустрічаються у клітинних стінках грампозитивних бактерій.
Є водорозчинними лінійними полімерами, що містять залишки гліцерину або рибола, пов'язані фосфодіефірними зв'язками. З тейхоевими кислотами пов'язані основні поверхневі антигени низки грампозитивних мікробів.
Вуглеводизустрічаються частіше у вигляді полісахаридів, які можуть бути екзо- та ендоклітинними. Серед екзоклітинних полісахаридів виділяють каркасні (входять до складу капсул) і екзополісахариди (виходять у зовнішнє середовище). Серед бактеріальних полісахаридів багато хто знаходить медичне застосування. Деккрани- Полісахариди з великою молекулярною масою, на вигляд нагадують слиз. 6% розчин - кровозамінник поліглюкін. Декстрановий гель сефадексвикористовується у колонковій хроматографії як молекулярне сито. Ендоклітинні полісахариди - запасні поживні речовини клітини (крохмаль, глікоген та ін.).
Ліпополісахарид (ЛПС)— один із основних компонентів клітинної стінки грамнегативних бактерій, це з'єднання ліпіду з полісахаридом. ЛПС складається з комплексу:
1.Ліпід А.
2.Одинакове для всіх грамнегативних бактерій полісахаридне ядро.
3.Термінальний сахаридний ланцюжок ( О- специфічний бічний ланцюг).
Синоніми ЛПС-ендотоксин, О-антиген.
ЛПС виконує дві основні функції - визначає антигенну специфічність і є одним із основних факторів патогенності. Це-ендотоксин, токсичні властивості якого виявляються переважно при руйнуванні бактеріальних клітин. Його токсичність визначається ліпідом А. ЛПС запускає синтез понад 20 біологічно активних речовин, що визначають патогенез ендотоксикозу, має пірогенну дію.
Нуклеїнові кислоти- ДНК та РНК. Рибонуклеїнові кислоти(РНК) знаходяться головним чином у рибосомах (р-РНК-80-85%), т(транспортні)-РНК-10%, м(матричні)-РНК-1-2%, головним чином в одноланцюговій формі. ДНК (дезоксирибонуклеїнова кислота) може знаходитися в ядерному апараті (хромосомна ДНК) або в цитоплазмі в спеціалізованих утвореннях-плазмідах-плазмідна (позахромосомна) ДНК. Мікроорганізми відрізняються за структурою нуклеїнових кислот, вмістом азотистих основ. Генетичний код складається всього з чотирьох букв (підстав) - А (аденін), Т (тимін), Г (гуанін) і Ц (цитозин). Найчастіше для характеристики мікроорганізмів використовують як таксономічну ознаку відсоткове співвідношення Г/Ц, яке суттєво відрізняється у різних груп мікроорганізмів.
Мікроорганізми синтезують різні ферменти- Специфічні білкові каталізатори. У бактерій виявлено ферменти 6 основних класів.
1.Оксидоредуктази-каталізують окислювально-відновні реакції.
2.Трансферази- здійснюють реакції перенесення груп атомів.
3.Гідролази-здійснюють гідролітичне розщеплення різних сполук.
4.Ліази-каталізують реакції відщеплення від субстрату хімічної групи негідролітичним шляхом з утворенням подвійного зв'язку або приєднання хімічної групи до подвійних зв'язків.
5. Лігази або синтетази - забезпечують з'єднання двох молекул, пов'язане з розщепленням пірофосфатного зв'язку в молекулі АТФ або аналогічного трифосфату.
6. Ізомерази - визначають просторове розташування груп елементів.
Відповідно до механізмів генетичного контролю у бактерій виділяють три групи ферментів:
— конститутивнісинтез яких відбувається постійно;
- індуцибельнісинтез яких індукується наявністю субстрату;
- репресибельнісинтез яких пригнічується надлишком продукту реакції.
Ферменти бактерій ділять на екзо- та ендоферменти. Екзоферменти виділяються у зовнішнє середовище, здійснюють процеси розщеплення високомолекулярних органічних сполук. Здатність до утворення екзоферментів багато в чому визначає інвазивністьбактерій - здатність проникати через слизові, сполучнотканинні та інші тканинні бар'єри.
Приклади: гіалуронідазарозщеплює гіалуронову кислоту, що входить до складу міжклітинної речовини, що підвищує проникність тканин (клостридії, стрептококи, стафілококи та багато інших мікроорганізмів); нейрамінідазуполегшує подолання шару слизу, проникнення всередину клітин та поширення у міжклітинному просторі (холерний вібріон, дифтерійна паличка, вірус грипу та багато інших). До цієї групи належать ензими, що розкладають антибіотики.
У бактеріології для диференціації мікроорганізмів за біохімічними властивостями основне значення часто мають кінцеві продукти та результати дії ферментів. Відповідно до цього існує мікробіологічна (робоча) класифікація ферментів
1.Сахаролітичні.
2.Протеолітичні.
3.Аутолітичні.
4.Окислювально-відновні.
5.Ферменти патогенності (вірулентності).
Ферментний склад клітини визначається геномом і є досить незмінною ознакою. Знання біохімічних властивостей мікроорганізмів дозволяє ідентифікувати їх за набором ферментів. Основні продукти ферментування вуглеводів і білків - кислота, газ, індол, сірководень, хоча реальний спектр для різних мікроорганізмів набагато більший.
Основні ферменти вірулентності - гіалуронідаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейрамінідаза, ДНК-аза. Визначення ферментів патогенності має значення при ідентифікації низки мікроорганізмів та виявлення їхньої ролі в патології.
Ряд ферментів мікроорганізмів широко використовується в медицині та біології для отримання різних речовин (аутолітичні, протеолітичні), генної інженерії (рестриктази, лігази).
Попередня12345678910111213141516Наступна
ПОДИВИТИСЯ ЩЕ:
Ферменти бактерій Ферментативна активність
Ферменти бактерій Ферменти є високоспецифічними біологічними каталізаторами, без яких неможливе життя та розмноження. Велика кількістьреакцій, що відбуваються за життя бактеріальної клітини, свідчить про існування у бактерій значної кількості ферментів. Ферменти – речовини білкової природи з великою молекулярною вагою. Деякі з них відносяться до протеїнів, інші складні білки. Вони побудовані з двох частин білка та небілкової частини, яка називається простетичною групою. До її складу можуть входити вітаміни. нуклеотиди, атоми заліза та ін. Зв'язок між білковою частиною ферменту і го простетичною групою може бути міцною і неміцною. За наявності неміцного зв'язку в розчинах настає дисоціація ферменту і може звільнятися вільна простетична група.
Легко дисоціюючі та ростетичні групи ферментів називаються коферментами. Зазвичай ферменти поділяються на такі основні групи:
1. Оксидоредуктази. всі ферменти, що каталізують окисно-відновні реакції.
2. Трансферази. каталізують перенесення тих чи інших груп (наприклад аміногруп, фосфатних залишків тощо).
3.
Методи вивчення ферментативної активності бактерій.
Гідролази, що розщеплюють шляхом гідролізу Гт або інші сполуки; до цього класу відносяться також фосфатази та дезампнази - ферменти, що відщеплюють відповідно гідролітичним шляхом фосфат або амонійні групи від різних органічних сполук.
4. Ліази, ферменти, що відщеплюють від субстратів негідролітичним шляхом певні групи (наприклад, СОг, НгО, SH2 тощо).
5. Ізомерази, що каталізують внутрішньомолекулярні перебудови в субстраті.
6. Лігази (синтетази) - клас ферментів, що каталізують приєднання один до одного двох молекул з одночасним розривом ппрофосфатного зв'язку в трифосфатах (наприклад, утворюють С-О, С-N або С-S зв'язку).
Найбільш високою ферментативною активністю мають сапрофіти; меншою мірою ця властивість виражена у патогенних бактерій. Вивчення ферментів патогенних бактерій має винятково важливе значення, оскільки на підставі визначення ферментативної активності мікробів можна диференціювати різні види та визначати природу того чи іншого збудника захворювань. Поряд із цим ферментативна активність мікробів визначає патогенез та клінічну картину інфекційного захворювання.
Ферменти диференціюють на екзо та ендоферменти. Екзоферменти виділяються клітиною у зовнішнє середовище, здійснюють процеси розщеплення високомолекулярних органічних сполук більш прості, доступні для асиміляції.
Ферменти бактерій поділяються на конституїтивні та індуцибельні. До першої групи належать ті ферменти, які синтезуються бактеріальною клітиною незалежно від того, на якому середовищі бактерія вирощується. Індуцибельні ферменти продукуються цією бактерією лише у відповідь на дію специфічного індуктора, що є в середовищі.
В основі всіх метаболічних реакцій у бактеріальній клітині лежить діяльність ферментів, що належать до 6 класів: оксиредуктази, трансферази, гідролази, лігази, ліази, ізомерази. Ферменти, що утворюються бактеріальною клітиною, можуть локалізуватися як усередині клітини – ендоферменти, так і виділятися у навколишнє середовище – екзоферменти. Екзоферменти відіграють велику роль у забезпеченні бактеріальної клітини доступними для проникнення всередину джерелами вуглецю та енергії. Більшість гідролаз є екзоферментами, які, виділяючись у навколишнє середовище, розщеплюють великі молекули пептидів, полісахаридів, ліпідів до мономерів та димерів, здатних проникнути всередину клітини. Ряд екзоферментів, наприклад гіалуронідазу, колагеназу та інші, є ферментами агресії. Деякі ферменти локалізовані у периплазматичному просторі бактеріальної клітини. Вони беруть участь у процесах перенесення речовин у бактеріальну клітину. Ферментативний спектр є таксономічною ознакою, характерною для сімейства, роду і – у деяких випадках – для видів. Тому визначення спектру ферментативної активності користуються при встановленні таксономічного положення бактерій. Наявність екзоферментів можна визначити за допомогою диференційно-діагностичних середовищ, тому для ідентифікації бактерій розроблені спеціальні тест-системи, що складаються з набору диференційно-діагностичних середовищ.
Ідентифікація бактерій щодо ферментативної активності
Найчастіше визначають ферменти класу гідролаз та оксидоредуктаз, використовуючи спеціальні методи та середовища.
Для визначення протеолітичної активності мікроорганізми засівають у стовпчик желатину уколом. Через 3-5 днів посіви переглядають та відзначають характер розрідження желатину. При розкладанні білка деякими бактеріями можуть виділятися специфічні продукти – індол, сірководень, аміак. Для їх визначення служать спеціальні індикаторні папірці, які поміщають між шийкою і ватною пробкою в пробірку з МПБ або (і) пептонною водою, засіяними мікроорганізмами, що вивчаються. Індол (продукт розкладання триптофану) забарвлює в рожевий колір смужку паперу, просоченого насиченим розчином щавлевої кислоти. Папір, просочений розчином ацетату свинцю, у присутності сірководню чорніє. Для визначення аміаку використовують червоний лакмусовий папірець.
Для багатьох мікроорганізмів таксономічною ознакою є здатність розкладати певні вуглеводи з утворенням кислот та газоподібних продуктів. Для виявлення цього використовують середовища Гісса, що містять різні вуглеводи (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу та ін.). Для виявлення кислот у середу доданий реактив Андріде, який змінює свій колір від блідо-жовтого до червоного в інтервалі рН 7,2-6,5, тому набір середовищ Гісса із зростанням мікроорганізмів називають «строкатим рядом».
Для виявлення газоутворення рідкі середовища опускають поплавці або використовують напіврідкі середовища з 0,5% агару.
Для того щоб визначити інтенсивне кислотоутворення, характерне для бродіння змішаного типу, у середу з 1% глюкози та 0,5% пептону (середовище Кларка) додають індикатор метиловий червоний, який має жовтий колір при рН 4,5 і вище, і червоний - при нижчих значеннях рН.
Гідроліз сечовини визначають за виділенням аміаку (лакмусовий папірець) та підлужування середовища.
При ідентифікації багатьох мікроорганізмів використовують реакцію Фогеса – Проскауера на ацетоїн – проміжне з'єднання при утворенні бутандіолу з піровиноградної кислоти. Позитивна реакціясвідчить про наявність бутандіолового бродіння.
Виявити каталазу можна по бульбашках кисню, які починають виділятися відразу після змішування мікробних клітин з 1% розчином перекису водню.
Для визначення цитохромоксидази застосовують реактиви:
1) 1% спиртовий розчин сс-нафтола-1;
2) 1% водний розчин N-диметил-р-фенілендіаміну дигідрохлориду.
Про наявність цитохромоксидази судять із синього фарбування, що з'являється через 2-5 хв.
Для визначення нітритів використовують реактив Гриса: поява червоного фарбування свідчить про наявність нітритів.
Ферментативні властивості бактерій
Для визначення сахаролітичних властивостей із вуглеводів зазвичай використовують лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу, маніт. Результат реакції визначається за допомогою різних індикаторів, що додають в живильне середовище, що дають кольорові реакції. Тому метод посіву на диференціально-діагностичні середовища отримав назву посіву на строкатий ряд. Іноді, так званий довгий строкатий ряд, додають арабінозу, ксилозу, галактозу, інулін, крохмаль і ін.
При розкладанні вуглеводів відбувається утворення органічних кислот (молочної, оцтової, мурашиної) та газу (СО2 та Н2). Кислоти викликають зміну рН середовища, що призводить до зміни її кольору в результаті реакції індикатора. Утворений газ витісняє рідина у верхній частині поплавця (при використанні рідкого строкатого ряду) або викликає розрив агару (при застосуванні напіврідких цукрів).
Середовища визначення сахаролитических властивостей
Середовища Гіссаскладаються з пептонної води, 1% вуглеводу та індикатора Андреде (кислий фуксин, знебарвлений лугом). У середу опускається поплавець, який при стерилізації заповнюється середовищем. При зброджуванні цукру бактеріями колір середовища змінюється на червоний, а газ накопичується в поплавці.
Напіврідкі цукрискладаються з 0,7% м'ясопептонного агару, 1% цукру та індикатора рН (водно-блакитна фарба та розолова кислота). Посів проводиться уколом. При ферментації цукру колір середовища стає блакитним, за наявності газоутворення в процесі посіву видно бульбашки газу, сам агар розривається. У лабораторній практиці широко застосовуються й інші диференційно-діагностичні середовища, до складу яких входять цукру.
Протеолітичні властивостібактерій (розщеплення білків) визначаються виявленням кінцевих продуктів ферментації білків(індолу, сірководню, аміаку) і по здатності розріджувати желатину (м'ясопептонний бульйон з 10-15% желатин).
Розріджувати желатинуздатні мікроби, що виділяють фер-мент типу колагенази.Процес розрідження йде зверху, причому різні види мікробів дають характерну для них форму, тому ця властивість також використовується в цілях ідентифікації бактерій.
Визначення ферментації білків за кінцевим продуктамрозпаду проводиться при сівбі на м'ясопептонний бульйон або пептонну воду.
Таким чином, завершуючи роботу з виділення чистої культури, ми маємо дані про морфологічні, тинкторіальні, культуральні та біохімічні властивості виділених культур бактерій. Це дає підставу приступити до видової ідентифікації – основне завдання останнього етапу бактеріологічного дослідження. І тому використовують визначник Берги. Це довідкове видання, каталог бактерій. У ньому всі мікроорганізми згруповані за основними біологічними властивостями. Порівнюючи властивості виділених культур з наведеними в опреде-лителі, встановлюють їх приналежність до групи, сімейства, роду і, нарешті, виду.
За морфологією, типом дихання, тинкторіальними властивостями, здатністю до спороутворення знаходять таксономічну групу для ідентифікованої культури. За повними морфологічними, тинкторіальними властивостями, типом дихання, спороутворенням, культуральними властивостями і деякими біохімічними ознаками знаходять сімейство, за методологічними особливостями (наявність капсул, джгутиків і т.д.), культуральним і біохімічним ознаками визначають рід, а внут- ри роду за біохімічними та антигенними властивостями встановлюють вид.
Самостійна робота студента
На практичному занятті
Контрольні питання
1. Харчування бактерій: аутотрофи та гетеротрофи.
2. Класифікація поживних середовищ.
3. Умови культивування бактерій.
4. Вимоги до поживних середовищ.
5. Хімічний складбактерій.
6. Поняття про чисту культуру та колонії.
7. Методи виділення чистих культур аеробних бактерій.
8. Етапи виділення чистої культури аеробних бактерій.
9. Культуральні властивості бактерій.
10. Біологічне окислення у аеробних та анаеробних бактерій.
11. Методи культивування анаеробів.
12. Методи виділення чистих культур анаеробів.
13. Значення ферментів для ідентифікації бактерій.
Тема: «Вплив чинників довкілля на мікроорганізми. Дія фізичних та хімічних факторів. Стерилізація та дезінфекція»
Ціль:
– навчитися методам стерилізації лабораторної судини та
поживних середовищ.
Завдання:
– вміти правильно підібрати відповідний метод стерилізації
різних об'єктів (середовище, посуд, інструменти тощо);
- освоїти основні групи дезінфікуючих речовин і механізм
їх дії на бактерії.
У зовнішньому середовищіна мікроби діють фізичні, хімічні та біологічні фактори, які або пригнічують, або стимулює їхню життєдіяльність.
До фізичним факторамвідносяться: висока і низька температура, висушування, промениста енергія, ультразвук, високий тиск.
Температура. Фізіологічна діяльність будь-якого мікроорганізму пристосована до певного температурного оптимуму. По відношенню до температури всі мікроорганізми поділяються на психрофіли(від 0 до +10 ° С), мезофіли(від +20°С до +40°С) та термофіли(+50 ° С – +70 ° С). Більшість патогенних мікроорганізмів належить до мезофілів.
Більшість мікроорганізмів стійкі до низьких температур (виняток становлять гонококи та менінгококи).
Ферментативна активність бактерій
Висока температура (+50°С – +60°С) згубно діє вегетативні форми бактерій. Суперечки витримують кип'ятіння до 2 годин. Згубна дія високої температури лежить в основі методів стерилізації.
Основні протиепідемічні заходи
У лабораторії
Стерилізація
Стерилізація – видалення чи знищення всіх живих мікроорганізмів (вегетативних та спорових форм) усередині або на поверхні предметів.
Стерилізація проводиться різними методами: фізичними, хімічними, механічними.
Основні вимоги до процесу стерилізації відображені у галузевому стандарті 42-21-2-82 «Стерилізація та дезінфекція виробів медичного призначення. Методи, засоби, режими».
Фізичні методи
Найпоширенішим методом стерилізації є дія високої температури. При температурі, що наближається до 100 °С, загибель більшості патогенних бактерій і вірусів. Спори ґрунтових бактерій-термофілів гинуть при кип'ятінні протягом 8,5 годин. Мікроорганізми, що потрапили в глибинні шари землі, або покриті кров'ю, що згорнулася, виявляються захищеними від впливу високої температури і зберігають свою життєздатність.
При стерилізації фізичними методамизастосовують дію високих температур, тиску, ультрафіолетового опромінення та ін.
Найпростіший, але надійний вид стерилізації — прожарювання. Його застосовують при поверхневій стерилізації негорючих та теплостійких предметів безпосередньо перед їх використанням.
Іншим простим і легко доступним методом стерилізації вважається кип'ятіння. Цей процес проводять в стерилізаторі - металевій коробці прямокутної форми з двома ручками і кришкою, що щільно закривається. Усередині розташована металева сітка, що виймається, з ручками з боків, на яку кладуть стерилізований інструмент. Основний недолік методу у тому, що не знищує суперечки, лише вегетативні форми.
При паровій стерилізації необхідно виконання певних умов, які гарантують її ефективність та збереження стерильності виробів протягом певного терміну. Насамперед стерилізація інструментів, операційної білизни, перев'язувального матеріалу повинна проводитися в упаковці. З цією метою використовують: стерилізаційні коробки (бікси), подвійне м'яке пакування з бязі, пергамент, вологоміцний папір (крафт-папір), поліетилен високої щільності.
Обов'язкова вимога до упаковки – герметичність. Терміни збереження стерильності залежать від виду упаковки і становлять три доби для виробів простерилізованих у коробках без фільтрів, у подвійній м'якій упаковці з бязі, паперу мішкової вологоміцної. У стерилізаційних коробках із фільтрами стерильність виробів зберігається протягом року.
Стерилізація сухим жаром
Процес стерилізації сухим жаром проводять у сухожаровій шафі (у печі Пастера та ін) - металевій шафі з подвійними стінками. У корпусі шафи розташовані робоча камера, в якій є полиці для розміщення предметів для обробки, та нагрівальні елементи, які служать для рівномірного нагрівання повітря у робочій камері.
Режими стерилізації:
температура 150 ° С - 2 години;
температура 160 ° С - 170 ° С - 45 хвилин - 1 година;
температура 180 ° С - 30 хвилин;
температура 200 ° С - 10-15 хвилин.
Необхідно пам'ятати, що при температурі 160 ° С папір і вата жовтіють за вищої температури - згоряють (обвуглюються). Початком стерилізації є той момент, коли температура печі досягає потрібної величини. Після закінчення стерилізації піч вимикається, прилад остигає до 50 ° С, після чого з нього виймають простерилізовані предмети.
Вироби в повітряному стерилізаторі можна стерилізувати без упаковки, але тільки в тих випадках, якщо вони використовуються відразу після стерилізації. Як упаковка може бути використаний папір мішковий, виготовлений за ГОСТ 2228-81, в ньому вироби зберігаються не менше 3-х діб.
Режим повітряної стерилізації представлений двома значеннями температури - 160 ° С протягом 2,5 години, або 180 ° С - протягом 1 години.
Стерилізація текучою парою
Цей вид стерилізації виробляється в апараті Коха або в автоклаві при кришці і відкритому випускному крані. Апарат Кохає металевий порожнистий циліндр з подвійним дном. Стерилізований матеріал завантажують в камеру апарата не щільно, щоб забезпечити можливість найбільшого контакту його з парою. Початковий підігрів води у приладі відбувається протягом 10-15 хвилин.
Поточною парою стерилізують матеріали, що розкладаються або псуються при температурі вище 100 °С. живильні середовищаз вуглеводами, вітамінами, розчини вуглеводів тощо.
Стерилізацію текучою парою проводять дробовим методом - при температурі не вище 100 оС по 20-30 хвилин протягом 3-х днів. При цьому вегетативні форми бактерій гинуть, а суперечки зберігають життєздатність і проростають протягом доби за кімнатної температури. Подальше прогрівання забезпечує загибель цих вегетативних клітин, що виникають із суперечок у проміжках між етапами стерилізації.
Тиндалізація- метод дробової стерилізації, при якому прогрівання матеріалу, що стерилізується проводиться при температурі 56-58 оС протягом години 5-6 днів поспіль.
Пастеризація- Одноразове нагрівання матеріалу до 50-65 ° С (протягом 15-30 хвилин), 70-80 ° С (протягом 5-10 хвилин). Використовується для знищення безспорових форм бактерій у харчових продуктах (молоко, соки, вино, пиво).
Попередня1234567891011121314Наступна
1. Особливості ферментативних реакцій
2. Вплив температури на активність ферментів
3. Вплив рН на активність ферментів
4. Активатори та інгібітори ферментів
I. Усі ферментативні реакції мають 4 особливості
· Висока активність ферментів;
· Оборотність дії ферментів;
· Специфіка дії ферментів;
· Лабільність (чутливість).
Висока активність ферментів.Ферменти зумовлюють високу швидкість ферментативної реакції, що характеризується числом оборотів ферментів – це кількість молекул субстрату, що перетворюється на продукти реакції при дії однієї молекули ферменту за одиницю часу. Наприклад, алкогольдегідрогеназа має активність 4700 од., фосфорилаза – 50000 од., a-амілаза – 16000 од.
Оборотність дії ферментіввстановив Данилевський. Під оборотністю впливу ферментів розуміють освіту комплексу ES та її розпад, тобто. реакції за участю ферменту можуть йти як в один бік (біосинтез), так і у зворотний (розпад).
Специфіка дії ферментів- кожен фермент діє лише на свій певний субстрат чи групу родинних субстратів. Наприклад, інвертаза діє сахарозу; a-амілаза – тільки на крохмаль та декстрини; протеази – на білки.
Існує дві точки зору, що пояснюють специфічність дії ферментів. За образним уявленням Еге. Фішера “фермент підходить до субстрату як ключі до замку”, тобто. топографія активного центру ферменту як високоупорядкована, а й жорстко закріплена. Активний центр ферменту відповідає топографії лише одного єдиного субстрату. Друга думка, запропонована Д. Кошландом - теорія індукованого відповідності ферменту та субстрату: конформація ферменту, особливо його активного центру, здатна до певних модифікацій. Залежно від конформаційної рухливості активного центру фермент здатний взаємодіяти або з небагатьма, або з різними субстратами. Іншими словами, в момент утворення комплексу ЕS відбуваються зміни в структурі як ферменту, так і субстрату. Внаслідок чого вони адаптуються один до одного.
Специфічність ферментів відіграє важливу роль у процесі обміну речовин у живому організмі. (Якби фермент не мав унікальних властивостей, то в живому організмі не було б обміну речовин)
За ознакою специфічності ферменти поділяються на 2 групи:
· Абсолютна специфічність - фермент діє тільки на одну-єдину речовину або каталізує тільки певне перетворення цієї речовини;
· Відносна або групова специфічність - ферменти діють відразу на багато субстратів, що мають ряд загальних структурних властивостей.
Лабільність (чутливість) -всі ферменти чутливі до підвищення температури та низьких значень рН, у яких відбувається втрата активності ферментів.
II. Найважливішим чинником, якого залежить активність ферментів, є температура.
Графічно залежність швидкості ферментативної реакції від температури виглядає так:
При 0°С, а тим більше при температурах нижче 0°С, дія більшості ферментів припиняється. Підвищення температури (крива 1) вище 0°С сприяє збільшенню активності ферментів (збільшується кількість зіткнень речовин, що реагують). За певної температури фермент проявляє максимальну активність. Більшість ферментів оптимальною температурою дії є 40-50°С. Подальше підвищення температури призводить до інактивації ферментів (зменшення активності) внаслідок термічної денатурації білкової молекули (крива 2).
Зміна швидкості реакції при підвищенні температури на кожні 10°З виражають температурним коефіцієнтом Q 10 . Температурний коефіцієнт є відношенням швидкість реакції при даній температурі v t +10 до швидкості реакції при температурі на 10°С нижче даної:
Величина Q 10 для хімічних реакцій лежить у межах 2-4, для ферментативної реакції - між 1 і 2; Q 10 ферментативних реакцій помітно знижується при підвищенні температури.
III. Кожен фермент виявляє свою дію в межах досить тонкої зони рН. Графічна залежність активності ферменту від рН має вигляд:
У кислому середовищі, при низьких значеннях рН, має форму ЕН 2+, у такій формі він малоактивний. При оптимумі рН фермент має максимальну активність і знаходиться у формі ЕН; при підлужуванні середовища, фермент набуває форми Е - .
Оптимальній активності відповідає певна область рН, причому кожен фермент має своє оптимальне значення рН дії (наприклад, бактеріальна a-амілаза має рН оптимум при 6, а a-амілаза мікроскопічних грибів - 4,7). Оптимальне значення рН пов'язані з амінокислотним складом ферментів.
Дзвоноподібна форма кривої порозуміється з амфотерною природою ферментів; висхідна та низхідна гілки цієї кривої є типовими кривими титрування та визначається значеннями рК іонних груп, які знаходяться в активному центрі ферментів.
Для визначення функціональних груп, що входять до активного центру ферменту, необхідно визначити залежності активності цього ферменту від рН за різних температур і визначити значення рК. Знаючи значення ΔрК для кислої та лужної гілки залежності v = f(pH) знаходять функціональні групи, які відповідають цьому значенню.
IV. Всі речовини, що супроводжують фермент у процесі реакції, можна підрозділити на активатори, інгібітори та нейтральні сполуки.
Активатори– хімічні сполуки, що підвищують дію ферментів (наприклад, глютатіон активізує дію протеаз, NaCl збільшує активність амілаз); інгібітори– сполуки, що пригнічують їхню активність (наприклад, група –CN пригнічує активність дихальних ферментів, що знаходяться в цитохромній системі) та нейтральні сполукине впливають на ферменти.
Процес інгібування може бути оборотнимі незворотним.
Зворотні інгібітори бувають:
· Конкурентної дії – інгібітор взаємодіє з функціональними групами активного центру ферментів. Інгібування в даному випадку залежить від концентрації субстрату: якщо [S] велика, вплив інгібітору [I] може не проявлятися; якщо ж [S] мала, то інгібітор може витіснити субстрат із сполуки з ферментом, дія якого при цьому загальмовується. Потрійний комплекс ЕSI при конкурентному інгібуваннініколи не утворюється.
· Безконкурентне інгібування спостерігається в тому випадку, коли інгібітор не здатний приєднуватися до ферменту, не може зв'язуватися з фермент-субстратним комплексом, переводячи його в неактивну форму.
· При змішаному пригніченні інгібітор діє як на ділянку зв'язування ES, так і на каталітичний центр ферменту.
