Конкретного гена передбачає можливість розрізнити специфічні сегменти ДНК або молекули РНК, що відповідають цьому гену, серед багатьох інших сегментів ДНК або молекул РНК, присутніх у зразку клітин або тканини. Коли аналізують геномну ДНК, проблема полягає в тому, щоб виявити і вивчити специфічний фрагмент ДНК, що цікавить, в складній суміші, що містить кілька мільйонів фрагментів, отриманих розщепленням геномної ДНК рестриктазами. Зі зразками РНК складність у тому, щоб виявити та виміряти обсяг і якість конкретної копії мРНК у сумарній РНК тканини, в якій шукана мРНК становить менше 1 на 1000 від загального числа копій РНК.
Рішення проблемивиявлення однієї рідкісної послідовності серед безлічі інших пов'язане з використанням гель-електрофорезу для поділу молекул ДНК або РНК за розміром з подальшою гібридизацією з нуклеотидним зондом, що ідентифікує цікаву молекулу.
Техніка Саузерн-Блоттінг(Блоттинг за Саузерном) дозволяє виявити і вивчати на грубому рівні безліч цікавих фрагментів в, здавалося б, не інформативної колекції з близько мільйона фрагментів, отриманих після обробки ДНК рестриктазами. Саузерн-блот, розроблений у середині 1970-х років, став стандартним методом дослідження конкретних фрагментів ДНК, розщепленої ферментами рестрикції. Спочатку під час цієї процедури з доступного джерела виділяють ДНК. Як джерело ДНК може бути використана будь-яка клітина організму, за винятком зрілих еритроцитів, що не мають ядра.
У ході аналізу зразків ДНКпацієнта зазвичай використовують геномну ДНК лімфоцитів, одержаних при звичайній пункції вени. У 10 мл периферичної крові міститься приблизно 108 лейкоцитів або близько 100 мікрограмів ДНК - доза, достатня для розщеплення рестриктазами. Геномна ДНК також може бути одержана з інших тканин, включаючи культуру фібробластів шкіри, амніотичних клітин або ворсин хоріону, що використовують для пренатальної діагностики, або з біопсійного зразка тканин різних органів (наприклад, печінки, нирки, плаценти).
Пробу з мільйонами різних фрагментів ДНК, що генеруються ферментативним розщепленням зразка геномної ДНК рестриктазами, наносять на поверхню агарозного гелю в точку старту. Потім фрагменти ДНК поділяють за розміром за допомогою електрофорезу в гелі агарози, при якому дрібні частинки переміщуються в електричному полі швидше за великі. Коли розділену таким чином досліджувану ДНК забарвлюють флюоресцентним барвником, наприклад, етідіум бромідом, фрагменти ДНК проявляються як флюоресцентні області, розподілені вздовж смуги руху в гелі, менші фрагменти - вище, великі - нижче. ДНК з'являється в гелі як змащену пляму, а не у вигляді дискретних смуг, оскільки зазвичай утворюється дуже багато різнорозмірних фрагментів ДНК, щоб відокремити один від одного.
Пляма двониткових фрагментів ДНКспочатку денатурують сильною лугом для поділу ниток ДНК. Отримані однониткові молекули ДНК потім переносять з гелю на паперові пористі фільтри (звідси друга назва методу – «перенесення по Саузерну»).
Для ідентифікаціїодного або декількох фрагментів, що цікавлять, серед мільйонів інших фільтр інкубують з комплементарним однонитковим міченим зондом в умовах, що сприяють спаровування. подвійних молекулДНК. Незв'язані зонди видаляють відмиванням, потім фільтр зі зв'язаними зондами радіоактивними витримують з фотоплівкою, що виявляє положення одного або більше фрагментів, до яких приєднався зонд. Таким чином, на плівці можна побачити специфічні радіоактивні смуги для кожного фрагмента ДНК людини, що цікавить, на вихідному гелі.
Здатність Саузерн-Блоттінгідентифікувати мутації обмежена, оскільки зонди можуть виявляти дефекти, що тільки мають відчутний вплив на розмір рестрикційного фрагмента, наприклад, великі делеції або інсерції (вставки). Мутація, що змінює одну або кілька підстав, не може бути виявлена, якщо не створює або не знищує сайт впізнавання рестриктази, що призводить до значної зміни розміру фрагмента, що виявляється зондом. Тим не менш, крім Саузерн-Блоттінг, існує безліч методів для виявлення мутацій, що впливають на одну або кілька пар підстав в гені.
Southern blot) - метод, який застосовується в молекулярній біології для виявлення певної послідовності ДНК у зразку. Метод Саузерн блот поєднує електрофорез в агарозному гелі для фракціонування ДНК з методами перенесення розділеної по довжині ДНК на мембранний фільтр для гібридизації. Метод називається на ім'я винахідника, англійського біолога Едвіна Саузерна.Інші технології переносу (блоту), наприклад, вестерн блот, нозерн блот, саузвестерн блот використовують подібні методи, але для визначення РНК або білка у зразку, і називаються за зразком методу, придуманого Саузерном. Оскільки Саузерн-блот названий на ім'я вченого, термін пишуть із великої літери, тоді як вестерн-блот і нозерн-блот - з малої літери.
Метод
- Рестрикція ендонуклеазами рестрикції для розрізання високомолекулярної ДНК більш дрібні фрагменти.
- Фрагменти ДНК піддаються електрофорез в агарозному гелі для поділу по довжині.
- У випадку, якщо деякі фрагменти ДНК довші за 15 кб, перед перенесенням гель обробляють, наприклад, соляною кислотою, яка викликає депуринізацію ДНК і полегшує перенесення на мембрану.
- У разі, коли використовують лужний метод перенесення, агарозний гель поміщають у лужний розчин, при цьому подвійна спіраль ДНК денатурує та полегшує зв'язування негативно зарядженої ДНК з позитивно зарядженою мембраною для подальшої гібридизації. При цьому руйнуються і залишки РНК.
- Листок нітроцелюлозної (або нейлонової) мембрани поміщають зверху або знизу від агарозного гелю. Тиск здійснюють безпосередньо на гель або через кілька шарів паперу. Для успішного перенесення необхідний щільний контакт гелю та мембрани. Буфер переноситься капілярними силами із ділянки з високим вмістом води в зону з низьким вмістом води (мембрана). При цьому здійснюється перенесення ДНК із гелю на мембрану. Поліаніонна ДНК зв'язується з позитивно зарядженою мембраною силами іонообмінних взаємодій.
- Для остаточного закріплення ДНК на мембрані остання нагрівається у вакуумі до температури 80 °C протягом двох годин або висвітлюється ультрафіолетовим випромінюванням (у разі нейлонових мембран).
- Здійснюють гібридизацію радіоактивно (флюоресцентно) міченої проби з відомою послідовністю ДНК з мембраною.
- Після гібридизації надлишок проби відмивають з мембрани та візуалізують продукти гібридизації шляхом авторадіографії (у разі радіоактивної проби) або оцінюють забарвлення мембрани (у разі використання хромогенного фарбування).
Результати
Гібридизація проби зі специфічним ділянкою ДНК, закріпленим на мембрані, свідчить про наявність аналізованої послідовності нуклеотидів у пробі.
Застосування
Саузерн блот, який проводять з геномної ДНК, обробленої ендонуклеазами рестрикції, може бути використаний для визначення числа копій геніву геномі. Проба, яка гібридизується тільки з єдиним фрагментом ДНК, який не був розрізаний рестриктазами, дає одну смугу на Саузерн-блоті, в той час як множинні смуги на блоті вказують на те, що проба гібридизувалась з декількома ідентичними послідовностями. Зміни умов гібридизації (підвищення температури, за якої проводять гібридизацію, зміна концентрації солі) призводять до підвищення специфічності та зниження гібридизації з близькими, але не ідентичними послідовностями.
Примітки
Див. також
- Блоттінг
- Нозерн Блоттінг
Wikimedia Foundation. 2010 .
Дивитись що таке "Саузерн блоттінг" в інших словниках:
Саузерн-Блоттінг- Блоттінг по Саузерну Метод виявлення специфічних нуклеотидних послідовностей шляхом перенесення електрофретично розділених фрагментів ДНК з агарозного гелю на нітроцелюлозний (паперовий) фільтр за рахунок капілярного ефекту.
саузерн-блот- — Тема біотехнології EN southern blotting … Довідник технічного перекладача
саузерн-блот- Southern Blotting Саузерн Блоттінг ДНК зразок. Саузерн блотінг включає електрофоретичний поділ ДНК і методи перенесення фрагментів ДНК з агарозного гелю на мембрану під дією електричного полядля подальшого аналізу з… … Тлумачний англо-російський словникз нанотехнології. – М.
Southern blotting, Southern transfer Саузерн блот, блот по Саузерну. Метод виявлення специфічних нуклеотидних послідовностей шляхом перенесення електрофретично розділених фрагментів ДНК з агарозного гелю на нітроцелюлозний. Молекулярна біологія та генетика. Тлумачний словник.
САУЗЕРН-БЛОТТИНГ- (Southern blot analysis) метод ідентифікації специфічних форм ДНК у клітинах. Молекули ДНК видаляються з клітин і за допомогою ферментів, що рестриктують, поділяються на невеликі фрагменти. Ці фрагменти відокремлюються один від одного, і за допомогою генного. Тлумачний словник з медицини
Саузерн-Блоттінг Блот-гібридизація по С- Саузерн блотінг, блот гібридизація за С. * Саузерн блотінг, блот гібридизація па С. * Southern blotting or S.
Метод ідентифікації специфічних форм ДНК у клітинах. Молекули ДНК видаляються з клітин і за допомогою ферментів, що рестриктують, поділяються на невеликі фрагменти. Ці фрагменти відокремлюються один від одного, і за допомогою генного зонда проводиться пошук. Медичні терміни
Саузерн блоттінг (від англ. Southern blot) метод, що застосовується в молекулярній біології для виявлення певної послідовності ДНК у зразку. Метод Саузерн блотінгу поєднує електрофорез в агарозному гелі для ... Вікіпедія
- (Від англ. Blot) загальна назваметодів молекулярної біології з перенесення певних білків або нуклеїнових кислот з розчину, що містить безліч інших молекул, на який-небудь носій (мембрану з нітроцелюлози, PVDF або ... Вікіпедія
Блоттінг- Блоттинг, блоттингове перенесення * блотинг, блотингави перенос * blotting or blot transfer процедура перенесення електрофоретично розділеної ДНК (див.), ДНК фрагментів, РНК, РНКфрагментів або білків з гелю (агарозного або поліакриламідного) на ... Генетика. Енциклопедичний словник
Для ідентифікації гена молекулу ДНК геному розщеплюють за допомогою ферментів рестриктаз на шматки розміром приблизно по 15-20 тисяч пар нуклеотидів. Розщеплений таким чином геном піддається електрофоретичному фракціонування в агарозному гелі. Після цього фракції ДНК денатурують нагріванням та переносять з агарозного гелю на нітроцелюлозний фільтр, де їх іммобілізують. Процес перенесення ДНК нагадує промокання (англійською – блот)і називається методом блоттингу по Саузерну.Сутність блоту полягає в тому, що агарозний гель поміщають на фільтрувальний папір, змочений у концентрованому сольовому розчині; потім на гель накладають нітроцелюлозний фільтр і зверху поміщають сухий фільтрувальний папір. Сольовий розчин вбирається в сухий папір; щоб це сталося, він повинен пройти крізь агарозний гель, а потім через нітроцелюлозний фільтр. ДНК переноситься разом із розчином, але затримується нітроцелюлозою. Іммобілізовану таким чином ДНК можна гібридизуватина місці із радіоактивним зондом. Зі специфічним зондом гібридизуватимуться лише комплементарні йому фрагменти. Так як радіозонний зонд, то гібридизацію можна виявити за допомогою авторадіографії. Кожна комплементарна послідовність проявляється у вигляді радіоактивної смуги, розташування якої визначається розміром фрагмента ДНК. Схема методу блот по Саузерну представлена на рис. 12.4.
Мал. 12.4. Схема блотінгу за Саузерном: розщеплення ДНК геному за допомогою рестриктазу на шматки 15000-20000 пар нуклеотидів; електрофоретичний поділ цих рестриктаз в агарозному гелі, перенесення їх на нітроцелюлозний фільтр, гібридизація з ДНК-зондом і виявлення гібридних молекул, що утворюються, методом авторадіографії; *) схема перенесення (блот).
Метод блот є високочутливим і точним і широко застосовується в криміналістиці, медицині, ветеринарії. В даний час метод молекулярної гібридизації розроблений для діагностики інфекційних хвороб сільськогосподарських тварин, наприклад, для виявлення збудника сибірки, бруцельозу, туберкульозу, ящуру, чуми свиней, чуми птахів, ентеровірусів і т.д. Цей метод є перспективним для вивчення племінних якостей тварин. Він має переваги перед прийнятим сьогодні у селекції методом вивчення маркерів білкового поліморфізму.
Вважають, що метод ДНК-гібридизації може успішно використовуватися в селекції бугаїв, так як геном бугаїв можна розділити на гени, які надалі виявляються блот. При цьому необхідно виділити близько 75 фрагментів ДНК, щоб оцінити геном за ознакою молочної продуктивності.
У Останніми рокамирозробляється новий методаналізу ДНК, так звана "геномна дактилоскопія" Геномна дактилоскопія включає такі етапи: виділення ДНК, фрагментацію її за допомогою ферментів - рестриктаз, фракціонування за допомогою електрофорезу в гелі. Фрагменти ДНК, що містять гіперваріабельні ділянки, виявляють за допомогою спеціального зонда. "проби Джефріса",з якою вони зв'язуються шляхом гібридизації. Ділянки гібридизації виявляються шляхом авторадіографії.
Дослідження показали, що в цій методиці як радіоактивний зонд може бути використана ДНК, виділена з бактеріофага Ml3. ДНК цього бактеріофага містить ще один тип гіперваріабельної послідовності, знайдений також і в геномі людини. Принцип будови цієї гипервариабельной послідовності загалом подібний до будовою мінісателітної ДНК Джеффриса. Використання цієї нової проби для генної "дактилоскопії" показало її високу ефективність та придатність для вирішення багатьох завдань. Справа в тому, що ці гіперваріабельні послідовності виявлені у різних представників живої природи – людини, тварин, рослин та бактерій, а тому ДНК-зонд бактеріофага M13 може бути використаний у широких масштабах. Наприклад, для ідентифікації особистості, для встановлення спорідненості будь-яких живих істот. Метод дає можливість вирішувати питання генетики та селекції тварин, вести відбір за корисними ознаками; використовуючи цей метод можна вести генну паспортизацію окремих високопродуктивних тварин, аналізувати родовід та отримані відомості використовувати для спрямованої селекції.
Існує ще один різновид гібридизаційного аналізу ДНК – це метод точкової (дот) гібридизації (рис.9), який виконується шляхом внесення досліджуваних зразків ДНК у денатурованому стані на капронові мембранні фільтри у вигляді точок. Наприклад (рис. 12.5) ДНК мікобактерій туберкульозу великої рогатої худоби в кількості 3 мкл (1,8 мкг/мл) у вигляді точок наноситься в квадрати (1,5 х 1,5 см).
Мал. 12.5. Дот-гібридизація ДНК-зонда M.bovis: А: 1 - M.bovis: 2,3 - ДНК з ураженої туберкульозом тканини; В: 1,2,3 – ДНК, виділена з тканин здорових тварин; З: 1 - ДНК збудника бруцельозу;
2 – ДНК збудника листерій;
3 – ДНК M. fortuitum.
Одноланцюгові молекули ДНК (денатуровані) адсорбуються на мембрані та фіксуються. Після цього на фільтр наноситься ДНК-зонд, мічений радіоактивним фосфором, тобто одноланцюжкова молекула M.bovis, мічена P 32 . Оскільки в даному випадку азотисті основи молекул ДНК M.bovis і міченого P 32 ДНК-зонда комплементарні, відбувається зв'язування азотистих основ ниток ДНК і ДНК-зонда з утворенням подвійний спіралі. Після цього незв'язані молекули ДНК-зонда відмиваються і гібридні молекули, що утворюються, виявляються шляхом радіоавтографії.
Після того, як ДНК, РНК або білки розділені, вони повинні бути перенесені на тверду підкладку для детекції та інших операцій, які в гелі йдуть важко. Процес перенесення, що призводить до іммобілізації молекул , тобто. закріплення в нерухомому стані, називається блотінгом (по англ. - blotting ). Як підкладка використовуються нейлонові або нітроцелюлозні мембрани.
Блоттінг(від англ. blotting – промокання) – це метод перенесення електрофоретичних фрагментів ДНК на спеціальну плівку (мембрану) з нітроцелюлози, що зв'язує (іммобілізує) одноланцюгові молекули ДНК.
Саузерн-Блоттінг(на прізвище автора, що його запропонував) заснований на переміщенні фрагментів ДНК завдяки капілярному ефекту. Процес перенесення фрагментів ДНК, що знаходяться в агарозному гелі, на плівку з нітроцелюлози за допомогою фільтрувального паперу схожий на промокання.
Аналіз проводять наступним чином:
– Виділену, очищену, денатуровану та розбиту на фрагменти ДНК поміщають на лист агарозного гелю, де відбувається електрофоретичний поділ фрагментів за масою та зарядом.
– Лист агарозного гелю поміщають на фільтрувальний папір, змочений концентрованим сольовим (буферним) розчином.
- Потім на гель накладають нітроцелюлозний фільтр, де відбувається іммобілізація (або адсорбція, або фіксація) одноланцюгових фрагментів ДНК.
– Поверх фільтра накладають стос листів сухого фільтрувального паперу, який забезпечує повільний струм буферного розчину через гель (тобто служить своєрідним капілярним насосом). Сольовий розчин, проходячи через агарозний гель, захоплює за собою фрагменти ДНК, які затримуються нітроцелюлозою та зв'язуються з нею, а розчин вбирається сухим фільтрувальним папером.
- Далі ДНК денатурують лугом, а фільтр витримують у вакуумі при температурі 80 0 С, внаслідок чого одноланцюгові фрагменти ДНК необоротно іммобілізуються (фіксуються) на нітроцелюлозі. При цьому розташування смуг іммобілізованої ДНК точно відповідає їхньому розташування в гелі.
- ДНК, пов'язану з фільтром, поміщають у розчин з міченим ДНК зондом, в якому відбувається гібридизація. Гібридизуватись (утворювати водневі зв'язки) зі специфічним зондом будуть лише комплементарні йому фрагменти ДНК, які можна виявити у вигляді світлих смуг на рентгенівській плівці, тобто. радіоавтографії нітроцелюлозного фільтра
Дот-блот. Для приготування дот-блот препарат ДНК або РНК наносять безпосередньо на фільтр. Крапельки препарату виглядають у вигляді точок на фільтрі, що пояснює назву типу блот (англ. dot-точка). 1) З геномної ДНК, попередньо обробленої ультразвуком, утворюються фрагменти завдовжки 5-10 пар нуклеотидів.
2) Щоб зробити ДНК- чи РНК-проби доступними зонду, потрібно денатурувати, тобто. перевести в одноланцюжкову форму. Це відбувається під впливом температури 100 °С.
3) Денатуровані нуклеїнові кислоти інкубують на льоду: швидке зниження температури запобігає їх ренатурацію, тобто. комплементарне спарювання ланцюгів. Денатуровану ДНК або РНК наносять безпосередньо на фільтр, який інкубують у розчині, що містить зонд.
4) Щоб аналізована нуклеїнова кислота не перейшла розчин, її необхідно зафіксувати на фільтрі (мембрані). Для цього використовують два типи фільтрів: нітроцелюлозний та нейлоновий.
Для іммобілізації нуклеїнових кислот на нітроцелюлозному фільтрі використовують прожарювання при 80 °С у вакуумі, а на нейлоновому фільтрі – УФ-опромінення протягом 3–5 хвилин.
5) Після інкубації препарату нуклеїнових кислот із міченим ізотопом зондом проводять радіоавтографію у спеціальній касеті або ідентифікацію нерадіоактивними методами.
Дот-блот дозволяє відповісти тільки на одне питання: чи є в даному зразку шукана послідовність нуклеотидів.
Нозерн-Блотт аналіззастосовується:
1) для виділення та аналізу РНК (наприклад, для з'ясування того, чи присутній в даному типі клітин мРНК, зчитані з даного гена, тобто експресується ген чи ні;
2) для визначення кількості цієї РНК та її зміни у розвитку даного типу клітин;
3) визначення розміру транскрипта якогось гена.
В даному випадку молекули РНК, виділені з клітини, поділяються за розмірами за допомогою гель-електрофорезу, а потім переносяться на фільтр. Після гібридизації з міченим одноланцюжковим зондом виявляються місця гібридизації (гомології) РНК та зонда.
Якщо нуклеотидна послідовність шуканого гена (або мРНК) не відома, але відомий білок, синтез якого він контролює, можна виділити невелику кількість чистого білка, визначити амінокислотну послідовність деякої його частини (достатньо знання 5-6 амінокислотних залишків). Користуючись таблицею генетичного кодуможна встановити всі можливі послідовності нуклеотидів у тій ділянці мРНК (або самого гена), який кодує дану амінокислотну послідовність. І тут можна синтезувати зонд для пошуку корисних клонів у бібліотеці генів.
Вестерн-Блоттінг(імуноелектроблоттінг, білковий блоттінг) - це метод ідентифікації унікальних білків. У його основі лежить явище високоспецифічної взаємодії антиген-антитіло. Таким чином, антигеном (мішенню) є білок, що визначається, а зондом – антитіло до нього.
Антитіла до білка, що досліджується, отримують різними способами. Найбільш простим є введення очищеної проби білка у кров'яне русло лабораторної тварини (зазвичай кролика). У його організмі виробляються антитіла (імуноглобуліни) до цього чужорідного білка. Це первинні антитіла, які й взаємодіятимуть із білком-мішенню.
Однак було б не раціонально вводити мітку для ідентифікації безпосередньо в ці антитіла. Для визначення різних білків потрібно було б мітити різні антитіла, що призвело б до їх високої вартості. Більш розумним виявилося використання універсальних антитіл – кон'югованих антиімуноглобулінів, які є, по суті, антитілами до антитіл, вироблених при використанні білка, що ідентифікується, як антигену. Наприклад, кон'юговані антиімуноглобуліни до Ig кролика взаємодіятимуть з усіма імуноглобулінами, синтезованими у кролика до різних антигенів. Таким чином, саме такі універсальні вторинні антитіла мають ізотопну або нерадіоактивну мітку. Крім неізотопної мітки, яка в ході ряду реакцій призводить до утворення нерозчинної забарвленої сполуки (як у разі блот нуклеїнових кислот), дуже часто використовують хемілюмінесцентну мітку, що має більш високу чутливість.
1) Екстракція білків із гомогенату
2) Поділ білків по молекулярних масах за допомогою SDS-електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ). Метод SDS-електрофорезу має на увазі денатурацію нативних білків. Таким чином, молекули білка, що мають однакову молекулярну масу, пройдуть у гелі однаковий шлях і вишикуються у вигляді смуги. Оскільки суміші присутні білкові молекули різного розміру, утворюється безліч смуг. Візуалізувати результати електрофорезу можна забарвленням білка (кумасі діамантовий синій, чорний амідо, фарбування сріблом). Фарбування сріблом має унікальну чутливість, що дозволяє визначити всього 0,1 нг білка в отриманій смузі. Це дуже важливо контролю кількості білка, нанесеного на гель.
3) Перенесення білків із гелю на мембрану. Це робиться тому, що поліакриламід не дозволяє дифундувати великим молекул імуноглобулінів до білка. А мобілізований на мембрані білок стає доступним антитілам. На відміну блоттингу нуклеїнових кислот перенесення білка на мембрану відбувається під впливом електричних сил, тобто. в електричному полі.
4) Отриманий блот інкубують з антисироваткою до білка, а потім антиіммуноглобулінами. Результат візуалізують відповідно до типу мітки, що використовується.
Обмеження:
1) великий розмір досліджуваних фрагментів, що значно перевищує довжину ДНК-зондів і перешкоджає прямому молекулярному аналізу;
2) неможливість довільного вибору кінців послідовностей, що досліджуються, що визначаються наявністю відповідних сайтів рестрикції у вихідній молекулі ДНК;
3) необхідність великої кількостідобре очищеної високомолекулярної геномної ДНК (не менше 10 мкг на одну реакцію, що рівноцінно 0,5-1 мл крові),
4) для геномної гібридизації - наявність радіоактивних ДНК-зондів з високою питомою активністю не менше 109 імп./хв*мкг), що діють обмежений проміжок часу, та спеціально обладнаного ізотопного блоку. До того ж, тривала експозиція автографів значно подовжує час отримання результатів.
5) велика трудомісткість досліджень
Блоттингом (буквально – промакування) називають перенесення фрагментів макромолекул (ДНК, РНК або білка), розділених за допомогою електрофорезу у гелі, на тверду підкладку – мембрану. У дослідженнях геному людини часто використовують метод блот, розроблений Саузерном, при якому олігонуклеотидний зонд, що знаходиться в розчині, гібридизується з ДНК, адсорбованої на мембрані (Саузерн-блот гібридизація, Southern blot hybridization). Геномну ДНК (зазвичай виділену з лейкоцитів або клітин плода) розщеплюють на короткі фрагменти, поділяють в агарозному гелі, переносять на мембрану, після чого ідентифікують специфічні ділянки за допомогою гібридизації з олігонуклеотидними зондами (рис. 65.6). Цим методом виявляють унікальні фрагменти ДНК, розмір яких становить приблизно одну мільйонну частину геному.
p align="justify"> Значимість методу для медицини обумовлена можливістю дослідити певний фрагмент геномної ДНК у будь-якої людини.
Метод використовують для виявлення великих перебудов у ДНК та деяких точкових мутацій (більшість точкових мутацій цим методом виявити не можна).
Денатурація ДНК здійснюється із лугом. Після закінчення електрофорезу гель поміщають у розчин основи (лугу), в якому двочепочечні фрагменти ДНК втрачають зв'язки і стають одноланцюжковими.
Перенесення ДНК з гелю на нітроцелюлозний або нейлоновий фільтр проводиться у буферному розчині. Безпосередньо на поверхню гелю кладуть фільтр та стос фільтрувального паперу. За рахунок капілярного ефекту створюється струм буфера, перпендикулярний до площини гелю. ДНК, що вимивається з гелю, затримується фільтром і практично повністю виявляється на його поверхні. Після перенесення однониркові нитки фіксують на фільтрі. Розташування фрагментів на фільтрі точно відповідає їхньому розміщенню в гелі. 3. Для того, щоб візуально виявити потрібні фрагменти (фіксована на фільтрі ДНК не видно), проводять гібридизацію зі специфічним по нуклеотидній послідовності міченим радіонуклідам або флюоресцентною міткою олигонуклеотидним синтетичним зондом (такий зонд складається з 16-30 пар опадів). Нуклеотидна послідовність зонда повинна бути повністю або частково комплементарна ділянці геномної ДНК, що вивчається.
При інкубації фільтра з розчином, що містить мічений зонд, відбувається гібридизація комплементарних ланцюгів ДНК зонда та фрагмента на фільтрі. Неспецифічні зв'язані молекули зонда відмиваються за допомогою спеціальної процедури.
Радіоактивно мічені ділянки виявляють шляхом експонування фільтра з рентгенівською плівкою (ауторадіографія). Після прояву на плівці видно смуги міченої зондом ДНК.
Нерадіоактивні мітки візуалізують за допомогою флюоресценції або опосередковано антитіл.
Отже: Саузерн-блот гібридизація - метод аналізу структури заданої області геному, заснований на:
2) розділення безлічі отриманих фрагментів за допомогою електрофорезу в плоскій пластині агарозного або іншого гелю;
3) перенесенні продуктів поділу на лист пористого матеріалу, наприклад, на нітроцелюлозний фільтр таким чином, що всі фрагменти ДНК переносяться на фільтр і закріплюються на ньому, створюючи відбиток, ідентичний розподілу фрагментів у гелі після поділу;
4) гібридизації фільтра з міченим радіоактивно або за допомогою барвника фрагментом ДНК або РНК (пробою), який за послідовністю відповідає ділянці геному, що аналізується. В результаті проба за рахунок комплементарних взаємодій пов'язується з тими ділянками фільтра, де знаходяться досліджувані фрагменти геному, і положення цих фрагментів ідентифікується за положенням мітки з проби на фільтрі.
І як було сказано вище, за допомогою Саузерн-блот гібридизації вдається визначати ідентичність або відмінність довжин фрагментів (поліморфізм довжин рестриктних фрагментів, ПДРФ), одержуваних при рестриктному розщепленні одного і того ж локусу в різних геномах, що порівнюються.
