1. Двухфазный рост бактерий. Диауксия. Рост без деления. Оценка роста бактерий. Количественная оценка роста бактерий.
2. Факторы влияющие на рост бактерий. Культуральные среды для роста бактерий. Простые и сложные культуральные среды. Твердые и жидкие культуральные среды.
3. Температура роста бактерий. Мезофильные бактерии. Термофильные бактерии. Психрофильные бактерии. Аэрация бактерий.
4. Величина рН необходимая для роста бактерий. Пигменты бактерий. Виды пигментов. Функции пигментов бактерий.
5. Спорообразование бактериями. Споры бактерий. Спорангии. Эндоспоры. Экзоспоры.
6. Морфология споры бактерий. Строение споры бактерий. Структура споры бактерий.
7. Споруляция бактерий. Стадии споруляции у бактерий. Расположение спор у бактерий.
8. Прорастание спор бактерий. Активация споры. Покоящиеся (некультивируемые) формы бактерий.
10. Внехромосомные факторы наследственности бактерий. Плазмиды бактерии. Виды плазмид. Функции плазмид бактерий.
В наши дни приоритетным направлением естествознания можно считать молекулярную биологию. Она тесно связана с микробиологией и в известном смысле является её детищем, так как в качестве основных моделей использует бактерии и вирусы, а одно из основных направлений молекулярной биологии - молекулярная генетика - долгое время являлась не чем иным, как генетикой бактерий и бактериофагов.
Изучение генетики бактерий имеет также и несомненный прикладной интерес, например в плане установления механизмов передачи патогенных свойств и устойчивости к лекарственным препаратам.
Бактерии - удобная модель для генетических исследований . Их отличает: относительная простота строения генома, позволяющая выявлять мутанты с частотой 10 -9 и ниже; гаплоидность, исключающая явление доминантности; половая дифференциация в виде донорских и реципиентных клеток; наличие обособленных, и интегрированных фрагментов ДНК (плазмид, транспозонов и т.д.); лёгкость культивирования и возможность получения популяций, содержащих миллиарды микробных тел.
Как и у других организмов, совокупность генов бактериальной клетки - геном - определяет её свойства и признаки (генотип ). Фенотип бактериальной клетки - результат взаимодействий между бактерией и окружающей средой - также контролирует геном (так как сами признаки закодированы в бактериальных генах).
Генетический материал бактерий
Ядерные структуры бактерий имеют характерное строение, отличающее их от ядер эукарио-тических клеток; их образуют так называемые хроматиновые тельца, или нуклеоиды, лишённые оболочки и включающие в себя почти всю ДНК бактерии.
Ядерные структуры можно наблюдать в фазово-контрастный микроскоп, где они выглядят как менее плотные участки цитоплазмы. Для их выявления в фиксированных мазках предложена реакция Фёльгена-Россенбёка.
В растущих бактериальных клетках нуклеоиды активно делятся, их количество иногда достигает 2-4.
Прокариотический геном
У бактерий обычно имеется одна замкнутая кольцевидная хромосома , содержащая до 4000 отдельных генов, необходимых для поддержания жизнедеятельности и размножения бактерий, то есть бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы обычно сопровождается её делением.
Некоторые виды (например, Brucella melitensis) стабильно содержат две кольцевые хромосомы , другие (Leptospira interrogans) - одну кольцевую хромосому и одну большую плазмиду, третьи - одну линейную хромосому (Streptomyces ambofaciens), то есть обладают сложными геномами.
Бактериальная хромосома содержит до 5*10 6 пар оснований. Для сравнения: геном человека составляет 2,9*10 9 пар оснований. Длина бактериальной хромосомы в развёрнутом состоянии составляет около 1 мм (Escherichia coli).
Некоторые бактерии содержат внехромосомные молекулы ДНК (плазмиды ) и мобильные элементы (либо плазмидные, либо хромосомные).
Генетика микроорганизмов как наука
Замечание 1
Примерно до конца $30$-х годов $XX$ века считалось, что микроорганизмы не имеют ядерного аппарата. Поэтому вопросы наследственности и изменчивости микроорганизмов тщательно не изучались.
Лишь с изобретением электронного микроскопа появилась возможность рассмотреть субмикроскопическую структуру клетки вообще и микроорганизмов в частности.
С начала $40$-х годов ученые-генетики обращают свое внимание на микроорганизмы. Бактерии, микроскопические грибы и вирусы становятся объектами генетических исследований. Формируется новая отрасль микробиологии – генетика микроорганизмов.
Генетика микроорганизмов – это раздел общей генетики, в котором предметом изучения служат микроорганизмы (бактерии, вирусы, микроскопические грибы) и особенности их наследственности и изменчивости.
Характерной особенностью микроорганизмов является гаплоидный набор хромосом или кольцевая молекула ДНК. Это дает возможность мутациям проявиться уже в первом поколении потомков.
Начало микробиологических генетических исследований
Благодаря изучению субмикроскопической структуры клеток микроорганизмов удалось найти ответы на многие вопросы генетики. Американсие генетики О.Т. Эйвери, К. Мак-Леод и М. Маккарти, проводя опыты на пневмококках, получили первые доказательства того, что материальным носителем наследственности является молекула ДНК. Исследования хлебной плесени позволило сформулировать положение, что один ген программирует синтез одной полипептидной цепи (одногобелка).
Но особенно интенсивно стали исследовать микроорганизмы с точки зрения генетики после того, как американскими микробиологами С. Лурия и М. Дельброком на примере кишечной палочки было доказано универсальность закономерностей мутационного процесса. Они доказали, что и бактерии подчиняются мутационным закономерностям.
В науке появился новый принцип изучения изменчивости у бактерий – клональный анализ. Он заключается в тщательном исследовании потомства одной клетки. Эта клетка становится родоначальником клона.
Изучение бактерий
В результате кропотливых исследований американским генетикам Дж. И Э. Ледербергам удалось доказать, что у бактерий мутации возникают независимо от условий их культивирования. Они разработали метод отпечатков, который позволил очень упростить приемы отбора микроорганизмов с желаемыми свойствами для дальнейших исследований. Они доказали, что больших популяциях клеток бактерий мутации происходят неупорядочено – спонтанно.
В $1946$ году было доказано, что бактериям тоже присущ половой процесс, были открыты явления конъюгации хромосом и рекомбинации генов, переноса генетической информации от одной бактериальной клетки к другой при посредстве бактериофага.
Существует мнение, что в кольцевой молекуле нуклеиновой кислоты клеток прокариот «прочтение информации» зависит от места начала «считывания». В зависимости от того, с какого нуклеотида начался этот процесс, находится и синтез того или иного белка.
Изучение фагов
Изучая особенности взаимоотношений «бактерия – бактериофаг», американские генетики открыли явление трансдукции (переноса генов между бактериальными клетками с помощью фагов) и обнаружили рекомбинацию у фагов. Это дало возможность изучать вопросы наследственности на уровне молекул (молекулярный уровень организации материи).
Немецкие микробиологи исследовали молекулу РНК. Для каждой из групп микроорганизмов была разработана методика исследований.
Генетика грибов и водорослей
Низшие грибы и водоросли имеют половой процесс несколько отличный от полового процесса других организмов. Благодаря их изучению появился новый метод – тетрадный анализ. Исследуя эти организмы, ученые разрабатывали методику объединения ядер генетически различных штаммов микроорганизмов. Все эти методы могут в дальнейшем послужить для выведения организмов с заданными качествами, для разработки новых поколений антибиотиков и биологически активных веществ, а также для борьбы со многими видами заболеваний растений, животных и, конечно же, человека.
Замечание 2
Но вопросы генной инженерии требуют осторожного подхода к изучению и применению полученной информации на практике. Ведь не ясно, к каким последствиям может привести появление генетически модифицированных организмов в природе и в человеческом организме.
Генетика бактерий и вирусов.
Формирование новых знаний. Лекционный блок
План изучения темы:
1. Генетический материал бактерий.
2. Классификация и биологическая роль плазмид.
3.Генетика вирусов
4. Биотехнология, генетическая инженерия.
5.Противомикробные препараты
Молекулярная биология, изучающая фундаментальные основы жизни, является в значительной степени детищем микробиологии. В качестве базовых объектов изучения в ней используют вирусы и бактерии, а основное направление - молекулярная генетика основана на генетике бактерий и фагов.
Бактерии - удобный материал для генетики. Их отличает :
Относительная простота генома (сопокупности нуклеотидов хромосом);
Гаплоидность (один набор генов), исключающая доминантность признаков;
Различные интегрированные в хромосомы и обособленные фрагменты ДНК;
Половая дифференциация в виде донорских и реципиентных клеток;
Легкость культивирования, быстрота накопления биомасс.
Общие представления о генетике.
Ген- уникальная структурная единица наследственности, носитель и хранитель жизни. Он имеет три фундаментальные функции.
1.Непрерывность наследственности - обеспечивается механизмом репликации ДНК.
2.Управление структурами и функциями организма - обеспечивается с помощью единого генетического кода из четырех оснований (А- аденин, Т- тимин, Г- гуанин, Ц- цитозин). Код триплетный, поскольку кодон - функциональная единица, кодирующая аминокислоту, состоит из трех оснований (букв).
3.Эволюция организмов - благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям.
В узкоспециальном плане ген чаще всего представляет структурную единицу ДНК, расположение кодонов в которой детерминирует первичную структуру соответствующей полипептидной цепи (белка). Хромосома состоит из особых функциональных единиц- оперонов.
Основные этапы развития (усложнения) генетической системы можно представить в виде следующей схемы:
кодон à ген à оперон à геном вирусов и плазмид à хромосома прокариот (нуклеоид) à хромосомы эукариот (ядро).
1.Ядерные структуры бактерий - хроматиновые тельца или нуклеоиды (хромосомная ДНК). У бактерий одна замкнутая кольцевидная хромосома (до 4 тысяч отдельных генов). Бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы (репликация ДНК) сопровождается делением клетки. Вегетативная репликация хромосомной (и плазмидной) ДНК обусловливает передачу генетической информации по вертикали- от родительской клетки- к дочерней. Передача генетической информации по горизонтали осуществляется различными механизмами - в результате конъюгации, трансдукции, трансформации, сексдукции.
2.Внехромосомные молекулы ДНК представлены плазмидами, мигрирующими генетическими элементами - транспозонами и инсервационными (вставочными) или IS- последовательностями.
Плазмиды- экстрахромосомный генетический материал (ДНК), более просто устроенные по сравнению с вирусами организмы, наделяющие бактерии дополнительными полезными свойствами. По молекулярной массе плазмиды значительно меньше хромосомной ДНК, содержат от 40 до 50 генов.
Их выделение в отдельный класс определяется существенными отличиями от вирусов.
1.Среда их обитания - только бактерии (среди вирусов, кроме вирусов бактерий- бактериофагов имеются вирусы растений и животных).
2.Плазмиды сосуществуют с бактериями, наделяя их дополнительными свойствами. У вирусов эти свойства бывают только у умеренных фагов при лизогении бактерий, чаще же всего вирусы вызывают отрицательный последствия, лизис клеток.
3.Геном представлен двунитевой ДНК.
4.Плазмиды представляют из себя"голые" геномы, не имеющие никакой оболочки, их репликация не требует синтеза структурных белков и процессов самосборки.
Плазмиды могут распространяться по вертикали (при клеточном делении) и по горизонтали, прежде всего путем конъюгационного переноса. Учитывая зависимость отналичия или отсутствия механизма самопереноса (его контролируют гены tra- оперона) выделяют конъюгативные и неконъюгативные плазмиды. Плазмиды могут встраиваться в хромосому бактерий- интегративные плазмиды или находиться в виде отдельной структуры- автономные плазмиды (эписомы).
Генетический материал бактерий. - понятие и виды. Классификация и особенности категории "Генетический материал бактерий." 2017, 2018.
Бактерии – прокариотические микроорганизмы, генетический материал которых в основном представлен единственной кольцевой двухцепочечной ДНК, называемой генетиками хромосомой. В относительно редких случаях хромосома представлена линейной молекулой ДНК.
Размер этой ДНК намного превышает размер самой бактериальной клетки. Так, например, у E. coli протяженность хромосомной ДНК равна 1300 мкм (1,3 мм – 4,6 х 10 6 п.н.), а размер клетки 1,1-1,5 х 2,0-6,0 мкм. Причем ДНК не заполняет всю клетку, а содержится только в ограниченной области, составляющей, весьма приблизительно, одну треть объема клетки.
Рис.1. Бактериальный геном и схема уровней его компактизации.
Отсюда следует, что ДНК существует в клетке в высокоупорядоченном (сконденсированном) состоянии в виде компактной структуры. Эта структура, отдаленно напоминая ядра эукариот, получила название нуклеоид и видна в микроскопе только после специфичных для ДНК окрасок (рис.1). В электронном микроскопе она выглядит как образование, состоящее из многочисленных петель, отходящих от плотной центральной области. Образование большого числа (до 140 на геном) петель, называемых доменами , является одним из уровней компактизации ДНК. Каждый домен закреплен у основания молекулой РНК и состоит примерно из 40 т.п.н. ДНК петель находится не в виде свободно вытянутого дуплекса, а имеет второй уровень компактизации за счет скручивания в сверхспиральные образования с помощью связи с белками HLP.
Эти белки имеют небольшой размер, обладают сильноосновными свойствами и прочно связываются с ДНК. По аминокислотному составу они напоминают гистоны эукариот.
Нуклеоид не отделен от цитоплазмы ядерной мембраной и прикреплен к мезосомам – специфическим впячиваниям цитоплазматической мембраны внутрь клетки. Связь ДНК со специфическим участком мембраны необходима для функционирования генома.
Кольцевая молекула ДНК бактерий (хромосома) представляет самореплицирующуюся генетическую молекулу – репликон . Репликация начинается с точки инициации репликации (ori – orign) , локализующейся, как правило, в участке прикрепления ДНК к мембране. От точки инициации репликация происходит последовательно, двунаправленно, по полуконсервативному механизму. Заканчивается репликация в районе терминации репликации (ter) , расположенном на участке кольцевой ДНК, противоположном точке начала репликации (рис.2).
Рис. 3. Распределение дочерних копий ДНК и деление клетки бактерий.
Число хромосом в одной клетке бактерий зависит от стадии развития и физиологических условий роста культуры. В логарифмической стадии роста у E. coli на 1 нуклеоид приходится 2,8 ДНК эквивалентов одного генома, вследствие замедленной сегрегации двух дочерних хромосом, или реинициации новых циклов репликации ДНК еще до деления клетки (рис.4).
Рис.4. Число хромосом в клетке в стационарной (А) и логарифмической (Б) стадиях роста культуры.
У некоторых бактерий клетки в норме содержат не одну, а много хромосом. Они могут формировать один или несколько нуклеоидов. Также наблюдается зависимость содержания ДНК в клетке от ее размеров, хотя это не означает соответствующего изменения объема генетической информации.
Для бактериальной ДНК характерна высокая плотность генов (1 ген на 1тпн). ДНК, кодирующая белки, составляет около 85-90% всей ДНК. Средний размер ДНК-последовательностей между генами – только 110-125 п.н. Некодирующая бактериальная ДНК занимает менее 1%, и она обычно представлена в виде транспозонов. Так, в ДНК штамма Escherichia coli K12 линии MG 1655 найдена 41 копия различных транспозонов (IS), которые участвуют в процессах внедрения и исключения плазмид. Многие фаги, исключаясь из генома бактерии не полностью, оставляют там в качестве следа некоторые свои гены. Эти остатки, не способные к самостоятельному перемещению и развитию, называют "криптическими" фагами.
Интроны встречаются в бактериальных геномах крайне редко. Имеются случаи перекрывания генов, где один ген находится внутри другого на той же нити ДНК. Для бактериальных геномов характерны опероны: у Е. coli 27% предсказанных транскрипционных единиц являются оперонами.
В клетке бактерий могут содержаться и другие репликоны, способные существовать отдельно от бактериальной хромосомы. Их называют плазмидами . Плазмиды представляют собой кольцевые (у некоторых видов линейные) молекулы двухцепочечной ДНК различных размеров от 1000 п.н. до почти трети величины самой бактериальной хромосомы. Количество и спектр плазмид в клетках бактерий может варьировать. Часто наблюдаются различия по спектру плазмид даже между клетками разных штаммов одного и того же вида бактерий. Некоторые плазмиды могут встраиваться в бактериальную хромосому, составляя при этом часть репликона бактерии, и могут вновь исключаться из нее, восстанавливая форму автономного репликона. Такие плазмиды называют эписомами .
В генетический материал бактерий могут быть включены и профаги.
Данная книга предназначена студентам медицинских образовательных учреждений. Это краткое пособие поможет при подготовке и сдаче экзамена по микробиологии. Материал изложен в очень удобной и запоминающейся форме и поможет студентам за сжатый срок детально освоить основные концепции и понятия курса, а также конкретизировать и систематизировать знания.
* * *
Приведённый ознакомительный фрагмент книги Микробиология: конспект лекций (К. В. Ткаченко) предоставлен нашим книжным партнёром - компанией ЛитРес .
ЛЕКЦИЯ № 4. Генетика микроорганизмов. Бактериофаги
1. Организация наследственного материала бактерий
Наследственный аппарат бактерий представлен одной хромосомой, которая представляет собой молекулу ДНК, она спирализована и свернута в кольцо. Это кольцо в одной точке прикреплено к цитоплазматической мембране. На бактериальной хромосоме располагаются отдельные гены.
Функциональными единицами генома бактерий, кроме хромосомных генов, являются:
1) IS-последовательности;
2) транспозоны;
3) плазмиды.
IS-последовательности – это короткие фрагменты ДНК. Они не несут структурных (кодирующих белок) генов, а содержат только гены, ответственные за транспозицию (способность перемещаться по хромосоме и встраиваться в различные ее участки).
Транспозоны – это более крупные молекулы ДНК. Помимо генов, ответственных за транспозицию, они содержат и структурный ген. Транспозоны способны перемещаться по хромосоме. Их положение сказывается на экспрессии генов. Транспозоны могут существовать и вне хромосомы (автономно), но неспособны к автономной репликации.
Плазмиды – дополнительный внехромосомный генетический материал. Представляет собой кольцевую, двунитевую молекулу ДНК, гены которой кодируют дополнительные свойства, придавая селективные преимущества клеткам. Плазмиды способны к автономной репликации, т. е. независимо от хромосомы или под слабым ее контролем. За счет автономной репликации плазмиды могут давать явление амплификации: одна и та же плазмида может находиться в нескольких копиях, тем самым усиливая проявление данного признака.
В зависимости от свойств признаков, которые кодируют плазмиды, различают:
1) R-плазмиды. Обеспечивают лекарственную устойчивость; могут содержать гены, ответственные за синтез ферментов, разрушающих лекарственные вещества, могут менять проницаемость мембран;
2) F-плазмиды. Кодируют пол у бактерий. Мужские клетки (F+) содержат F-плазмиду, женские (F-) – не содержат. Мужские клетки выступают в роли донора генетического материала при конъюгации, а женские – реципиента. Они отличаются поверхностным электрическим зарядом и поэтому притягиваются. От донора переходит сама F-плазмида, если она находится в автономном состоянии в клетке.
F-плазмиды способны интегрировать в хромосому клетки и выходить из интегрированного состояния в автономное. При этом захватываются хромосомные гены, которые клетка может отдавать при конъюгации;
3) Col-плазмиды. Кодируют синтез бактериоцинов. Это бактерицидные вещества, действующие на близкородственные бактерии;
4) Tox-плазмиды. Кодируют выработку экзотоксинов;
5) плазмиды биодеградации. Кодируют ферменты, с помощью которых бактерии могут утилизировать ксенобиотики.
Потеря клеткой плазмиды не приводит к ее гибели. В одной и той же клетке могут находиться разные плазмиды.
2. Изменчивость у бактерий
Различают два вида изменчивости – фенотипическую и генотипическую.
Фенотипическая изменчивость – модификации – не затрагивает генотип. Модификации затрагивают большинство особей в популяции. Они не передаются по наследству и с течением времени затухают, т. е. возвращаются к исходному фенотипу.
Генотипическая изменчивость затрагивает генотип. В основе ее лежат мутации и рекомбинации.
Мутации – изменение генотипа, сохраняющееся в ряду поколений и сопровождающееся изменением фенотипа. Особенностями мутаций у бактерий является относительная легкость их выявления.
По локализации различают мутации:
1) генные (точечные);
2) хромосомные;
3) плазмидные.
По происхождению мутации могут быть:
1) спонтанными (мутаген неизвестен);
2) индуцированными (мутаген неизвестен).
Рекомбинации – это обмен генетическим материалом между двумя особями с появлением рекомбинантных особей с измененным генотипом.
У бактерий существует несколько механизмов рекомбинации:
1) конъюгация;
2) слияние протопластов;
3) трансформация;
4) трансдукция.
Конъюгация – обмен генетической информацией при непосредственном контакте донора и реципиента. Наиболее высокая частота передачи у плазмид, при этом плазмиды могут иметь разных хозяев. После образования между донором и реципиентом конъюгационного мостика одна нить ДНК-донора поступает по нему в клетку-реципиент. Чем дольше этот контакт, тем большая часть донорской ДНК может быть передана реципиенту.
Слияние протопластов – механизм обмена генетической информацией при непосредственном контакте участков цитоплазматической мембраны у бактерий, лишенных клеточной стенки.
Трансформация – передача генетической информации в виде изолированных фрагментов ДНК при нахождении реципиентной клетки в среде, содержащей ДНК-донора. Для трансдукции необходимо особое физиологическое состояние клетки-реципиента – компетентность. Это состояние присуще активно делящимся клеткам, в которых идут процессы репликации собственных нуклеиновых кислот. В таких клетках действует фактор компетенции – это белок, который вызывает повышение проницаемости клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, поэтому фрагмент ДНК может проникать в такую клетку.
Трансдукция – это передача генетической информации между бактериальными клетками с помощью умеренных трансдуцирующих фагов. Трансдуцирующие фаги могут переносить один ген или более.
Трансдукция бывает:
1) специфической (переносится всегда один и тот же ген, трансдуцирующий фаг всегда располагается в одном и том же месте);
2) неспецифической (передаются разные гены, локализация трансдуцирующего фага непостоянна).
3. Бактериофаги
Вирионы фагов состоят из головки, содержащей нуклеиновую кислоту вируса, и отростка.
Нуклеокапсид головки фага имеет кубический тип симметрии, а отросток – спиральный тип, т. е. бактериофаги имеют смешанный тип симметрии.
Фаги могут существовать в двух формах:
1) внутриклеточной (это профаг, чистая ДНК);
2) внеклеточной (это вирион).
Фаги, как и другие вирусы, обладают антигенными свойствами и содержат группоспецифические и типоспецифические антигены.
Различают два типа взаимодействия фага с клеткой:
1) литический (продуктивная вирусная инфекция). Это тип взаимодействия, при котором происходит репродукция вируса в бактериальной клетке. Она при этом погибает. Вначале происходит адсорбция фагов на клеточной стенке. Затем следует фаза проникновения. В месте адсорбции фага действует лизоцим, и за счет сократительных белков хвостовой части в клетку впрыскивается нуклеиновая кислота фага. Далее следует средний период, в течение которого подавляется синтез клеточных компонентов и осуществляется дисконъюнктивный способ репродукции фага. При этом в области нуклеоида синтезируется нуклеиновая кислота фага, а затем на рибосомах осуществляется синтез белка. Фаги, обладающие литическим типом взаимодействия, называют вирулентными.
В заключительный период в результате самосборки белки укладываются вокруг нуклеиновой кислоты и образуются новые частицы фагов. Они выходят из клетки, разрывая ее клеточную стенку, т. е. происходит лизис бактерии;
2) лизогенный. Это умеренные фаги. При проникновении нуклеиновой кислоты в клетку идет интеграция ее в геном клетки, наблюдается длительное сожительство фага с клеткой без ее гибели. При изменении внешних условий могут происходить выход фага из интегрированной формы и развитие продуктивной вирусной инфекции.
По признаку специфичности выделяют:
1) поливалентные фаги (лизируют культуры одного семейства или рода бактерий);
2) моновалентные (лизируют культуры только одного вида бактерий);
3) типовые (способны вызывать лизис только определенных типов (вариантов) бактериальной культуры внутри вида бактерий).
Фаги могут применяться в качестве диагностических препаратов для установления рода и вида бактерий, выделенных в ходе бактериологического исследования. Однако чаще их применяют для лечения и профилактики некоторых инфекционных заболеваний.
