Кроме того для них характерны свойства, обусловленные наличием в молекуле обоих видов функциональных групп и бензольного ядра.
Фенолокислоты представляют собой твердые кристаллические вещества. Фенолокислоты, которые имеют в своем составе один фенольный гидроксил, сравнительно малорастворимые в холодной воде, но хорошо растворяются в горячей воде и многих органических растворителях. С увеличением числа фенольных гидроксилов растворимость фенолокислот увеличивается.
Распространение в природе [ | ]
Фенолокислоты очень распространены в природе, поэтому их можно извлечь из природного сырья (такого, например, как боярышник кроваво-красный , рябина черноплодная , прополис). Фенолокислоты является основным компонентом (55-85 %) остатка от перегонки древесной смолы пек древесный .
Синтез [ | ]
Нередко для получения фенолокислот применяют синтетические способы. В частности, 2-оксибензойную (салициловую) кислоту добывают из и углекислого газа в автоклавах при 180 °C с последующей обработкой продукта реакции соляной кислотой синтез Кольбе :
C6H5ONa + С02 180 С → С6Н4 (ONa) COOH ; С6Н4 (ONa) COOH + НС1 → С6Н4 (ОН) СООН + NaCl
Химические свойства [ | ]
Фенолокислоты одновременно обладают свойствами карбоновых кислот и фенолов . Кроме того, для них характерны свойства, обусловленные наличием в молекуле обоих видов функциональных групп и бензольного ядра.
Разложение при нагревании [ | ]
Фенолокислоты при нагревании разлагаются с образованием фенольных соединений и углекислого газа. Например, при нагревании салициловая кислота разлагается на фенол и углекислый газ:
НОС6Н4СООН → С6Н5ОН + СО2 салициловая кислота фенол углекислый газ
Реакция этерификации (по карбоксильной группе) [ | ]
Фенолокислоты как и карбоновые кислоты, благодаря наличию карбоксильной и гидроксильной групп способны образовывать эфиры .
Например, образование эфира салициловой кислоты - ацетилсалициловой кислоты:
НОС6Н4СООН + Н3С-С(=О)-О-(О=)С-СН3 → С6Н4(СООН)-О-СО-СН3 + СН3СООН салициловая кислота уксусный эфир ацетилсалициловая кислота уксусная кислота
и образовании эфира галловой кислоты одна молекула галловой кислоты реагирует своим карбоксилом , другая - фенильным гидроксилом . Китайский танин является глюкозидом дигалловой кислоты и глюкозы.
Образование солей [ | ]
Фенолокислоты, как и карбоновые кислоты образуют соли. Например, образование салицилата натрия при взаимодействии салициловой кислоты и едкого натрия:
НОС6Н4СООН + NaOH → НОС6Н4СООNa + Н2О салициловая кислота салицилат натрия
Реакция с хлоридом железа(III)(по фенольной группе) [ | ]
Нередко возникает необходимость в выявлении наличия салициловой кислоты и других фенолокислот в консервированных продуктах. Тогда в пробирку помещают 2-3 мл исследуемого раствора и добавляют несколько капель 1 %раствора хлорида железа (III). Возникает фиолетовая окраска. В отличие от фенола, она может появиться и в спиртовом растворе кислоты. Окраска возникает в результате образования комплексных солей при взаимодействии фенольных групп шести молекул фенолокислоты с молекулой FeCl3.
Галловая кислота легко взаимодействует с хлоридом железа(III) и образует продукт реакции сине-чёрного цвета (чернила).
Реакция нуклеофильного замещения с галогенами [ | ]
Наличие в молекуле фенолокислот фенольных групп (-ОН) позволяет им вступать в реакции замещения атомов водорода бензольного ядра на галогены при обычных условиях. Бензойная кислота и обычные ароматические кислоты в такие реакции не вступают.
Например, бромирование салициловой кислоты:
НОС6Н4СООН + Br2 → НО(Br)С6Н3СООН + НОС6Н3(Br)СООН + 2НBr салициловая кислота п-бромсалицилова кислота о-бромсалицилова кислота
Фенол]]ьная группа в молекуле салициловой кислоты действует как заместитель первого рода - направляет атомные группы и отдельные атомы на замещение атомом водорода бензольного ядра в о- и п-положении относительно себя.
Типичные представители и их производные, использование фенолокислот в медицине и промышленности [ | ]
2-оксибензойная или салициловая кислота - типичная фенолокислотa, её иногда называют оксибензойной кислотой НОС6Н4СООН. Соли и эфиры салициловой кислоты - салицилаты. Впервые была добыта с эфиров, содержащихся в тканях некоторых растений, - гаультеровои эфирного масла Gaultheria procumbers . Салициловая кислота - твердое кристаллическое вещество . Обладает бактерицидным действием. Её соли и эфиры широко используют в медицине и ветеринарии как лекарственные препараты. Салициловую кислоту широко используют для производства лекарственных средств (например, ацетилсалициловой кислоты, фенилсалицилата), протравных красителей, фунгицидов (например,), пахучих веществ (метилсалицилат , бензилсалицилат), антисептиков в пищевой промышленности, при консервировании, как реагент для колориметрического определения в растворах железа и меди, как кислотно - основной индикатор при люминесцентном анализе (при рН = 2,5…4,6 и при наличии кислоты появляется синяя люминесценция) и т. д.
3,4,5 - Триоксибензойная, или галловая кислота - фенолокислота, содержащая в составе молекулы одну
В разделе всесторонне рассматриваются закономерности и механизмы биологического действия фенольных соединений - обширной группы органических веществ, повсеместно распространенных в растительном мире. Выполняя наряду с белками, нуклеиновыми кислотами, углеводами и другими соединениями важные функции в растительных клетках и тканях, в составе пищевых продуктов, а также разнообразных лекарственных средств народной и современной медицины поступают в организм человека и оказывают заметное воздействие на работу различных органов.
Рассчитано на врачей, биологов и биохимиков.
Фенолы как лекарственные средства
Знакомство с основными проявлениями физиологической и фармакодинамической активности растительных фенолов убедительно показало, что многие из них имеют большие перспективы использования при лечении и предупреждении болезней человека.
Литература
Основные классы органических соединений: белки, нуклеиновые кислоты, жиры, а также необходимые для жизни минеральные соли и микроэлементы изучаются глубоко и всесторонне. Сотни тысяч страниц кропотливых наблюдений, бесчисленные эксперименты, надежды и разочарования тысяч исследователей, споры и дискуссии, ошибки и открытия - вот что скрыто за лаконичными строками учебников по биохимии.
Белки, состоящие из , водорода, кислорода, азота и серы, действительно выполняют важнейшие жизненные функции. Они образуют вместе с жироподобными веществами (липидами) биологические мембраны - основные структуры, из которых построены клетки. - основные двигатели, катализаторы обмена веществ - важнейшего жизненного процесса. Белки-гормоны - это средства регулирования и управления в машине жизни. Есть в организме белки сократительные, они работают в скелетных мышцах, осуществляют движение ворсинок, продвижение пищевого комка по пищеварительному тракту; белки транспортные, они переносят на поверхности своих огромных молекул многие жизненно важные вещества; белки-антитела - крошечные защитники нашего внутреннего мира от посягательств невидимых врагов - бактерий и вирусов. Нет такой формы жизнедеятельности, такого биологического процесса, в котором белки не играли бы первостепенную роль.
Обнаруженные впервые в составе клеточного ядра, стали известны позже белков, а их назначение в организме установлено в полной мере лишь в последние десятилетия. Оно теснейшим образом связано с ролью белков. Крупные молекулы нуклеиновых кислот (самые большие из них состоят из сотен тысяч и даже миллионов углерода, водорода, кислорода и азота) хранят в своих длинных нитях, в последовательности своих атомных группировок наследственную память клеток, информацию о структуре и производстве белков.
Углеводы и жиры устроены значительно проще, и роль их в организме менее разнообразна. Сгорая в тканях в процессе медленного биологического окисления, они отдают свою энергию на поддержание температуры живого тела, на осуществление процессов биосинтеза нужных ему органических соединений. Жиры и жироподобные вещества входят вместе с белками в состав биологических мембран, на поверхности которых протекают все важнейшие жизненные процессы. Углеводы (они названы так потому, что построены из углерода, водорода и кислорода, причем два последних элемента содержатся в них в том же соотношении, что и в воде, 2:1), особенно крупные молекулы полисахаридов, играют роль энергетического запаса (крахмал, гликоген). Некоторые из них, например , входят в состав оболочки растительных клеток, образуют волокна, служат важным опорным материалом в тканях растений.
Строение и жизненная роль витаминов, само их существование стали известны лишь в XX в. Потребность в них невелика, но они необходимы: при их отсутствии или недостатке человек тяжело заболевает и может даже погибнуть от или пеллагры, бери-бери или . Поступая в организм с пищей, витамины обязательно присутствуют в жидкостях тела неизменными или подвергшись обменной активации. Например, витамин B1 превращается в организме в кокарбоксилазу (дифосфат тиамина), обладающую максимальной активностью.
Водорастворимые витамины В2, В6, РР, Н, фолиевая (Вс) и пантотеновая (В3) кислоты играют в организме роль коферментов. Это своего рода набор стандартных инструментов, с помощью которых ферментные белки выполняют свои каталитические функции: разрезают или соединяют молекулы, переносят группы атомов от молекул одного вещества к другому, ускоряют течение определенных обменных реакций.
Жирорастворимые витамины (A, D, Е, К) входят в состав биологических мембран - основного структурного элемента клеток. Состоят мембраны из двойного слоя липидных (жироподобных) молекул, липидного «моря», в котором «плавают», подобно айсбергам, белковые частицы. Мембраны разделяют клетку на отсеки, выполняющие разные функции; осуществляют перенос молекул, ионов, электрических зарядов, основные реакции обмена веществ. Жирорастворимые витамины стабилизируют структуру мембран, защищают их от окислительного разрушения, обеспечивают нормальную работу мембранных ферментов.
Особняком стоит витамин С; он растворим в жидкостях организма, но коферментной функцией, видимо, не обладает. Как и жирорастворимые витамины, он обладает антиокислительной активностью, но не входит в состав мембран, а в составе биологических жидкостей организма омывает их поверхность.
К середине XX в. пора великих открытий в области изучения химического состава и строения органических веществ, казалось, миновала. Биохимики устремились в погоню за микроэлементами - веществами, присутствующими в живых тканях в исчезающе малых количествах, изучая их роль как кофакторов ферментативного катализа, ускорителей или замедлителей реакций обмена веществ.
Но есть, оказывается, большой и разнообразный класс органических соединений, биологическая роль которых далеко еще не выяснена. Это фенольные соединения. О них-то и пойдет речь в книге.
Их много, этих веществ. Они встречаются в каждом растении, в каждой клетке их тела, в корнях и листьях, в плодах и коре - везде, где их ищут ученые. Из растений выделено несколько тысяч фенолов, и список этот продолжает расти. На долю фенольных соединений приходится до 2-3% массы органического вещества растений, а в некоторых случаях - до 10% и даже более. Конечно, такие распространенные и многочисленные органические вещества должны выполнять какие-то важные, необходимые жизненные функции.
Нельзя сказать, что о роли фенольных соединений растений ничего не известно. Исследования в этой области ведутся более 100 лет, и в последние десятилетия сделано особенно много. Но очень скоро выяснилось странное обстоятельство. Белки и нуклеиновые кислоты, углеводы и липиды содержатся в тканях как растений, так и животных, содержатся примерно в одинаковых или близких соотношениях. Они построены по единому плану, состоят из одних и тех же исходных элементов (аминокислот, нуклеотидов, жирных кислот, моносахаридов). В пищеварительном тракте травоядных растительная пища расщепляется на такие универсальные простые компоненты, входящие в состав собственных органических соединений этих животных, а затем и плотоядных. Причем удается проследить судьбу одних и тех же веществ на протяжении всей биологической цепи, от растений до животных и человека, и функции этих веществ на разных участках цепи у разных видов, классов и типов организмов оказываются примерно одинаковыми и даже аналогичными.
Совершенно иначе обстоит дело с фенольными соединениями. С их обилием и разнообразием в растительном мире резко контрастирует присутствие в тканях животных и человека лишь немногочисленных представителей фенольного «царства», содержащихся к тому же в очень малых, даже ничтожных, количествах. И несмотря на наличие близкого сходства химической структуры растительных и животных фенолов, никому еще не удалось совершенно уверенно и надежно доказать, что между ними существует такая же преемственная связь, как между растительными и животными белками или углеводами. Попытки проследить (с помощью метода меченых атомов или других современных научных методик) за судьбой фенольных соединений растительной пищи в организме животных и человека дали один и тот же результат: основная масса растительных фенолов сгорает в теле животных до и воды, подобно тому как ведут себя углеводы или жиры.
Но является ли роль углеводов чисто энергетической или какая-то их часть все же используется при биосинтезе животных фенолов? Окончательного ответа на этот вопрос еще нет.
Какова же функция растительных фенолов в организме животных и человека, куда они постоянно поступают с пищей? Попытаемся ответить на этот вопрос на страницах раздела.
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА. СССР
ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИТОПАТОЛОГИИ
- : ; - ; : " " ;
На правах рукописи Лидия Владимировна РОЗУМ. ■ ■ 4 .
ФЕНОЛКДРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ПОРАЖЕНИИ СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНОЙ
(06,01.11 -фитопатология и защита растений)
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук ■
МОСКВА -1977
Работа выполнена в лаборатории биохимии и физиологии растений ■ Северо-Кавказского научно-исследовательского института фитопатологии. * -
Научные руководители: доктор биологических нзук^ профессор М. И. Запрометов, кандидат сельскохозяйственных наук В. В. Чигрии.
Официальные оппоненты: доктор биологических наук^про-, фессор В, И. Кефели, кандидат биологических наук В..В. Ма-
Ведущее учреждение ~ Всесоюзный научно-исследовательский институт защиты растений.
Защита диссертации состоится « 197 г.
в 10 час. на заседании специализированного Совета Всесоюзного научно-исследовательского института фитопатологии,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. , ""
Ученый секретарь- ;
кандидат сельскохозяйственных
Наук; . ■ ^
Г. В. Пыжнкова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время веб большей значение приобретает защита урожая от вредителей и болезней, Одним из вредоносных заболеваний зерновых культур является стеблевая ржавчина пшеницы, вызывающая огромные потери урожая и снижающая товарные качества зерна (Петерсон, 1958; Чумаков и др., 1965). Основной способ борьбы с этим заболеванием - выведение устойчивых сортов. Однако, несмотря на несомненные успехи, одни только селекционные мероприятия не могут привести к радикальному решению этой ^проблемы, поскольку в природе рано или поздно получают распространение биотипы патогена, способные поражать новые сорта. Достигнутые к настоящему времен» успехи в области патофизиологии позволяют считать, что выявление физиолого-биохимических механизмов устойчивости к патогену будет способствовать направленному изысканию эффективных средств защиты растений от ржавчины.
Сведения об изменении фенольного обмена у растений пшеницы при заражении ржавчиной весьма немногочисленны и довольно противоречивы. Анализ литературных данных показывает, что отсутствие единой точки зрения на роль фенольных соединений в латогии"¡¿¿^¿^1 i.аВ.^ТТ%VЛ[сслеД°"
МОПиШ» Li., l. "l t i»V. I 1
ватёлн определяли либо суммарное содержание всех полифенолов в здоровых и зараженных растениях (Kiraly and Farkas, 1962; Seevers and Daly, 1970), либо количество одного какого-то метаболита (El-Naghy, 1963 и др.). Кроме того, эти исследования проведены, как правило, на очень молодых растениях. В природе же реальной угрозе заражения ржавчнной подвергаются более взрослые растения, а с возрастом механизм ответных реакций может существенно изменяться (Чпг-рнн и сотр., 1969; Bateman et al., 1965).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение метаболизма фенол на рбо новых кислот у растений пшеницы при заражении стеблевой ржавчиной. Фенол-карбоновые кислоты представляют собой ключевые метаболиты фенольного обмена и являются предшественниками дело-го ряда ароматических соединений и лигнина (Занрометов, -1964, 197Ü; Тоуэрс,1968). Они обладают высокой физиологической активностью и участвуют в самых различных метаболических процессах, и есть основания думать, что они играют ■важную роль в формировании ^рсакции^верхчувствнтслыю-сти».
В задачи исследования входило:
1) изучение постинфекционных изменений основных фенол карбоновых кислот.пшеницы в начале развития болезни и в момент появления видимых симптомов заболевания;
2) определение активности ферментов, имеющих отношение к накоплению этих фенолкарбоиовых кислот;
3) получение сведений о фунгн- и цитотоксичностн феноль-ных соединений пшеницы, об их физиологических функциях.
Научная новизна, практическая ценность работы и пути реализации. Впервые проведено систематическое исследование обмена фенолкарбоиовых кислот у растений пшеницы при поражении стеблевой ржавчнной. Изучены самые ранние изменения содержания фенолкарбоиовых кислот при заражении, которые имеют непосредственное отношение к некробиозу. Обнаружено, что развитию защитных некрогенных реакций предшествует накопление в тканях устойчивых растений определенных фенолкарбоиовых кислот, обладающих высокой фун-гн- и цитотоксичностью. В отличие от известных работ о роли полифенолов в устойчивости растений пшеницы к инфекционным заболеваниям, наши исследования выполнены на взрослых растениях пшеницы, которые в природе подвергаются реальной угрозе заражения ржавчиной. Результаты экспериментов имеют значение для понимания механизмов защитных реакций растений и могут быть использованы при направленном синтезе новых протнворжавчннных фунгицидов.
Апробация. Материалы диссертации докладывались на И Всесоюзном симпозиуме по-фенольным соединениям (Алма-2
Ата, 1971) и на Ш Всесоюзном симпозиуме по фенольным соединениям (Тбилиси, 1976).
Объем работы. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав экспериментальной части, заключения, списка цитируемой литературы; включает 12 рисунков и 21 таблицу в тексте. Список использованных литературных источников содержит 230 наименований, из них 131 - на иностранных языках.
В разделе I обзора приведены данные о широком распространении фенольных соединений в растительном мире и перечислены важнейшие функции этих соединений в процессах метаболизма. В разделе II раскрывается важная роль полифенолов в устойчивости растений к грибным, бактериальным и вирусным заболеваниям.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава!. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ
Исследования проводили на двух парах сортов: Капли и Эммер, относящихся к виду ТгШсипт dicoccum, Баллади 116 и Кубанка 3, принадлежащих к виду Triticum durum. Растения выращивали в теплице до фазы выхода в трубку и заражали свежесобранными уредоспорами 40-й расы Puccinia graminis Pers f. sp. tritici Eriks, et Herrn. Первый сорт каждой пары является устойчивым к этой расе ржавчины, второй - восприимчивым. При заражении сорта Баллади 116 отмечен тип реакции 0-0; Капли-0; -1, Эммер и Кубанка 3-3-4 по классификации Гоймана (Гойман Э., 1954). Таким образом, сорта Капли н Баллади 116 представляли несовместимую комбинацию с данным патогеном, сорта Эммер и Кубанка 3 - совместимую.
Образцы зараженных н контрольных (незараженных) растений отбирали в самом начале патогенеза (второй день после заражения) и в репродуктивную фазу развития гриба (пятый день). Целые листья замораживали жидким-азотом, растирали, лиофилизировали, запаивали в ампулах и сохраняли на холоду для проведения анализов.
Растворимые фенольные соединения экстрагировали горячим 80%-ным этанолом. Последний упаривали, водный остаток подкисляли до pH 2,0, и свободные фенолкарбоновые кислоты извлекали диэтиловым эфиром, Глюкозидносвязаниые фе-
нолкарбоновые кислоты определяли после двейадцатичасо-вого гидролиза водного остатка препаратом р-глюкозидазы (0,07"мг/мл) при 37° С и последующей экстракции диэтнловым эфиром. Растворимые этерифицнрованные формы фенолкар-боновых кислот определяли после пятичасового гидролиза (2 и. NaOH в атмосфере азота) водного элюата, оставшегося после обработки раствора р-глюкозндазой. Обесцвеченный растительный материал, оставшийся после извлечения растворимых полифенолов, инкубировали пять часов в атмосфере азота с 2 и, NaOH, и освободившиеся при гидролизе этанол-нерастворимые эфирносвязанные фенолкабоновые кислоты извлекали диэтнловым эфиром после подкисления смеси до рН 2,0, Разделение фенолкарбоновых кислот осуществляли двумерной хроматографией с использованием в первом направлении 1%-ной уксусной кислоты и во втором - органической фазы смеси толуол-уксусная кислота - вода (4:1:5). Хроматограммы обрабатывали слабым раствором соли прочного красного ГГ, фенолкарСюновыс кислоты элюировали из бумаги 0,05 н. "NaOH в этаноле и использовали для количественного определения.
Определение гликозндазной активности проводили на препаратах белка, выделенного из здоровых и зараженных растений, с использованием в качестве "субстратов соответствующих гликозидов л-нитрофенола (Jaynes et al., 1972).
Активность фенилаланин-лммиак лиазы определяли по методу Кукола и Кона (Koufcol and Conn, 1961).
Изучение способности растений пшеницы связывать фе-нольные соединения проводили на примере феруловой кислоты, которую вводили в растения в виде 2-10~3М раствора путем засасывания через срезы листьев. Об интенсивности связывания судили, сравнивая количество кислоты, оставшейся в свободном состоянии, с количеством, обнаруживаемым в гидролизуемых формах через 3 часа после окончания поглощения раствора.
Действие фенольиьгх соединений на прорастающие уредо-споры стеблевой ржавчины изучали в диапазоне концентраций от 10_г М до 2,5 Ю-5 М, При изучении влияния различных фенол>ных соединений на токсичность феруловой кислоты последнюю использовали в концентрациях 2- Ю-3 М и 5 lO-4 М. Другие фенольные соединения добавляли к феруловой кислоте в соотношениях 1:5; 1:2; 2:1; 5:1. Растворы фепольных соединений смешивали с агаром, наносили на предметные стекла и на них напылнвали уредосиоры. Стекла выдёржнва-4
ли 18 часов в темноте при 18-20° С. Подсчет проросших спор проводили в 10 полях зрения микроскопа.
О цитотоксических свойствах феиолкарбоновых кислот судили по распаду хлорофилла в отрезках листьев ■пшеницы, инкубируемых на растворах изучаемых соединений. Определение содержания хлорофилла проводили по методу, описанному Кулаевой (Кулаева, 1973). Кроме этого, цитотоксиче-ские свойства фенольных соединений оценивали по их влиянию на способность тканей листа поглощать из раствора краситель- кислый фуксин; краситель затем элюировали из тканей и колориметрировали при 545 нм.
Для изучения возможности повышения устойчивости растений пшеницы к ржавчине (путем увеличения уровня эндогенных полифенолов) зараженные растения восприимчивого сорта Кубанка 3 трехкратно обрабатывали растворами фенолкарбоновых кислот в концентрации Ю-3 М, На девятый день учитывали количество развившихся пустул на контрольных и обработанных растениях.
Результаты экспериментов подвергали вариационно-ста-тнстпческой обработке с использованием критерия Стьюден-та (Снедекор, 1961) при уровне вероятности Р = 0,95,
Глава II. ПОСТИНФЕКЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФЕНОЛКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ
И ЛИГНИНА У РАСТЕНИИ ПШЕНИЦЫ ПРИ ЗАРАЖЕНИИ СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНОИ
Фенолкарбоновые кислоты (ФКК) растений пшеницы обнаруживаются как в свободном состоянии, так и в составе гликозидов и эфиров как растворимых в этаноле, так и нерастворимых. Суммарное количество всех форм ФКК в листьях пшеницы колебалось в пределах 2228-3259 мкг/г сухого вещества,"Содержание растворимых эфиров составило в среднем 49% от общего количества, нерастворимых - 39%, гликозидов- 9% и свободных ФКК- 3%. Во фракциях свободных, гликозидносвязанных, эфирносвязанных растворимых форм ФКК вами были идентифицированы феруловая, ванилиновая, сиреневая, п-кумаровая, п-оксибензойная кислоты, тогда как во фракции нерастворимых эфиров - только феруловая, ванилиновая и п-кумаровая. Такие кислоты, как феруловая и ванилиновая, имеются во всех фракциях ФКК, почти всегда количественно преобладают н, вероятно, могут считаться одними из основных компонентов фенольного комплекса растений пшеницы.
Заражение пшеницы стеблевой ржавчиной вызывает существенные измеиения в обмене ФКК. Данные таблицы 1
(% к контролю)
Фенолкарбоновые КИСЛОТЫ Несовместимая комбинация Совместимая комбинация
Ка пли Ба.плали 116 Эммер Кубанка 3
Феруловая...... 233* 171* 64* 85
Ванилиновая..... 183* 125 76 10)
Сиреневая...... 126* 117 194* 85
п-Кумароная..... 169* 131* 127 100
п-ОксибешоАиая.... 133 120
* Различия достоверны при Р=0,95.
свидетельствуют о том, что устойчивые сорта характеризуются накоплением свободных феполкарбоновых кислот в отличие от восприимчивых сортов, которые не обладают этой способностью. У устойчивого сорта Капли, дающего типичную реакцию «сверхчувствительности», в начале развития некробиоза достоверно возросло содержание всех ФКК. Содержание наиболее токсичной для ■патогена феруловой кислоты в этом случае возрастает более чем в два раза. У сорта Баллади 116, реакция которого ближе к иммунной, также обнаружено увеличение всех фенол кар бонов ых кислот. Накапливаются ванилиновая и сиреневая кислоты, которые могут усиливать токсическое действие феруловой кислоты. У восприимчивых же сортов заражение ржавчиной, как правило, не сопровождалось накоплением свободных феполкарбоновых кислот. Более того, в тканях сортов Эммер и Кубанка содержание феруловой кислоты даже снижалось, количество других ФКК тоже уменьшалось или оставалось на уровне контроля. Отмеченные изменения сохранялись и на пятый день после заражения, однако они выражены не так отчетливо, и, по-видимому, менее важны с точки зрения выяснения факторов некробиоза.
Во фракции гликозидов заражение не вызвало существенных изменений, хотя определенная тенденция к снижению их уровня может быть отмечена к пятому дню после инокуляции, особенно у устойчивых сортов. Значительные изменения наблюдались во фракциях растворимых и нерастворимых эфи-ров. Как показывают данные таблицы 2, содержание этанол-растворимых эфиров ФКК резко уменьшилось уже на второй день после заражения. Это уменьшение особенно значительно у устойчивого сорта Капли, для которого характерна б
Фе і і олка р бон овые кислоты Несовместимая комбинация Совместимая комбинация
Капли Баллади 116 Эммер Куба яка 3
дни после заражения.
2 5 2 5 2 5 2 i-
Феруловая...... 37* 36* 91* 90* 68* 70* 99 98
Ванилиновая..... зо* 36* 64* 78* 37* 79 115 98
Сиреневая...... 10* 38* 79* 77* 36* 108 89 96
и-Кумаровая..... 28* 10* 102 87 33* 66* 69* 88
л-Оксибснзойлая. . . . 97 73* Ш 114
* Различия достоверны при Р=0,95,
обширная иекротизация в местах внедрения патогена. Снизилось содержание феруловон, ванилиновой, сиреневой кислот и у устойчивого сорта Баллад» 116. У восприимчивого сорта Эммер заражение также способствует уменьшению эфирно-связанных этаиолрастворнмых ФКК, однако эти изменения [¡ыражены менее отчетливо, У высоковосприимчнвого сорта Кубанка 3 количество растворимых эфиров практически пе изменяется под действием заражения. "
Достаточно четкие различия между устойчивыми и восприимчивыми сортами обнаруживаются во фракции нерастворимых эфиров, ассоциированных с материалом клеточных стенок (таблица 3). Устойчивые сорта реагируют на заражение резким снижением содержания эфнрносвязанной феруловой кислоты. Этот факт может свидетельствовать о том, что какие-то реакции метаболизма этой кислоты играют важную роль в процессе патогенеза. Количество ванилиновой и п-кумаровой кислот также обнаруживает тенденцию к уменьшению у устойчивых растений в начале развития болезни. В противоположность этому у восприимчивых растении инфекция, как правило, не вызывает снижения содержания нерастворимых форм ФКК, а в некоторых случаях можно даже наблюдать заметное увеличение их.
Данные о количественных изменениях различных форм ФКК свидетельствуют о том, что заражение по-разному влияет на фенольный обмен устойчивых и восприимчивых растений пшеницы. Так, устойчивым сортам свойственно значительное накопление свободных ФКК, которые обладают высо-
Фе її ол к а р боно в ые кислоты Несовместимая комбинация Совместимая комбинация
Капли Баллади 11 б Эммер Кубанка 3
дни после заражения
Феруловая 36* 25"" 27* 36* 98 128* 80 152*
Ванилиновая 74* 115 85 103 167* 99 166* 127*
п-Кумаровая 83* ПЗ 75 101 І 83* 90 26* 124
* Различия с контролем достоверны при Р=0,95.
кой физиологической активностью (Бардинская и др., 1962; Кйс et al„ 1956), н довольно глубокие изменения во фракции связанных форм фенольных соединений. В противоположность этому у восприимчивых сортов некоторые изменения претерпевает лишь количество растворимых в этаноле форм ФКК. В то же время нерастворимые в этаноле ФКК не подвергаются заметным воздействиям.
Представлялось вероятным, что накопление свободных ФКК может происходить вследствие: а) повышения активности гидролитических ферментов, среди которых наиболее интересны гликозндазы, способные гидролизовать не только глико-эиды, но и некоторые эфиры (Тоуэрс, 1968); б) усиления биосинтеза ФКК de novo и в) подавления процессов связывания их в виде гликозидов, эфиров и лигнина {Тоуэрс, 1968). Результаты определения гликозидазной активности, представленные в таблице 4, показывают, что у иммунного сорта Балла-дн 116 активизируются как р-, так и а-гликозидазы; у устойчивого сорта Капли, образующего обширные некрозы, активизируются только р-гликозидазы. Гликозидазная активность восприимчивых растений, как правило, снижается или остается на уровне контроля.
Изучение активности фенил ал анин-аммиак лиазы (НФ 4.3.1.5) - (ФАЛ-лиазы), которая играет чрезвычайно важную роль в биосинтезе фенольных соединений, показало, что у устойчивого сорта заражение приводит к существенному увеличению активности этого фермента (рис. 1). У восприимчивого сорта наблюдали незначительное"повышение активности ФАЛ-лиазы или даже снижение ее активности по сравнению с контролем, особенно в начальной стадии развития инфекции.
дни после жтт
Рис. І Акпмості фшлшдон - шш яшм ь тщтшш литих дошцм.
Определение интенсивности связывания экзогенной феру-ловой кислоты показало, что в начале патогенеза в тканях не-зараженных листьев сорта Капли за 3 часа 98% этого соединения превращалось в связанные формы, тогда как в зараженных листьях - только 95%. У сорта Эммер интенсивность связывания при заражении возросла с 93 до 98%. Хотя эти различия невелики, они статистически достоверны и свидетельствуют об ослаблении процессов связывания фенолкарбо-новых кислот при заражении устойчивого сорта и усилении - у восприимчивого.
Таблица 4
Активность гликозидаз (мгк субстрата/м{Гбелка/час) в листьях Пшеницы (через два дня после заражения стеблевой ржавчмной)
Глнкозидазы Несовместимая комбинация Совместимая комбинация
Капли Балладн 116 Эммер Кубанка 3
здоров ые зараженные здоровые зараженные здоровые зараженные здоровые зараженные
Р-глюкоз ида за 338 389 75)Е>9 508 387 595 496
а-глюкоз и да за 6 6 0 7 10 5 7 8
р-галактозидаза 165 183 46 130 273 226 101 102
а-галактозид аз а 89 85 39 99 51 37 46 31
устойчивому (Капли) сортам, позволяет предполагать, что в первом случае успех защитной реакции связан не столько с количеством высвободившихся ФКК, сколько с быстротой осуществления этого процесса, обусловленной резким активированием р- и а-гликозидаз. Таким образом, накопление свободных ФКК в листьях устойчивого сорта может быть связано с усилением гликозидазной активности тканей листа, активированием ФАЛ-лиазы и ослаблением процессов связывания свободных кислот.
Как указывалось выше, доля растворимых и нерастворимых эфиров ФКК составляет в сумме 88% всего количества ФКК пшеницы, тогда как на долю свободных приходится 3%. " Очевидно, что постинфекционную убыль эфиров ФКК (табл. 2 и 3) никак нельзя объяснить только усилением их гидролиза, с которым частично может быть связано накопление свободных ФКК в листьях устойчивых растении (табл. 1). Возникает вопрос о возможных причинах столь резкой убыли эте-рифицированных ФКК, особенно заметной в листьях устойчивых растений. Одной из таких "причин является, вероятно, интенсификация дыхания зараженных растений (особенно устойчивых) и связанная с этим большая потеря углерода в виде СОг. Изучение этого вопроса показало, что на 2:й день. после заражения у сортов Капли и Эммер выделение С02 листьями увеличилось на 54% и 45% соответственно. Резкое усиление потерь углерода вполне могло снизить объем биосинтеза вторичных соединений (в том числе лигннна) в связи с необходимостью поддержать на оптимальном уровне концентрации биологически более важных метаболитов.
Другой причиной убыли эфиров ФКК в листьях может быть перераспределение фенолкарбоновых кислот между надземными органами и корнями. Одним из подтверждений обоснованности этого предположения служит тот факт, что в корнях растений устойчивого сорта Капли в начале заболевания количество свободных ФКК при заражении возросло на 43%, связанных (растворимых и нерастворимых)-на 78% и общее количество - на 75%. У сорта Эммер заметно (на 58%) увеличилось только содержание первой фракции. Общее количество ФКК, в том числе связанных форм, возросло незначительно (на 10% и 7% соответственно). Таким образом, сопоставляя данные таблиц 2 и 3 с результатами определения ФКК в корнях, можно предположить, что накопление фенолкарбоновых кислот в этих органах в известной мере коррелирует с убылью связанных форм ФКК в листьях. Полученных данных недостаточно, чтобы датъ завершенную интерпретацию взаимосвязи фенольного обмена надземных органов и корневой системы. Возможно, что убыль эфиров ФКК в зараженных листьях связана с тем, что заражение способно вызвать изменения метаболизма в органах, отдерфных от места развития патогена (Рац|есЬ, 1974), и усиление биосинтеза ФКК в корнях ведет к «перехвату» каких-то предшественников, которые в норме направляются из корней в листья. Нельзя, по-видимому, исключить и возможность оттока непосредственно растворимых ФКК из листьев в корни. Проведенный нами эксперимент показал, что при погружении корней пшеницы в растворы 4-метнлумбеллиферо-]0
конртмр M
я<г* uf* w* mi* b"ti3 /гг
Фмомя -кислота-"
Ii "шаровая кислота
".........- бшиновая кислота
Puc. з Токсичность фенолклрбоно&ых кислот
№ КЛЕТОК МСТЕННй ПШЕЩЫ.
на н п-оксибензойной кислоты эти вещества накапливались в листьях и стеблях.
Таким образом, резкая убыль эфиров ФКК в зараженных листьях устойчивых сортов может быть связана, с одной стороны, с патологически возросшей интенсивностью дыхания и, с другой - с усилением биосинтеза ФКК в корнях.
Глава III. ИЗУЧЕНИЕ ФУНГИ- И ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИИ
Наибольшей токсичностью для прорастающих уредослор гриба обладают феруловая кислота и кониферилозый спирт, которые даже в концентрации 5* Ю-" М подавляли прорастание спор на 44% и 38% соответственно. Другие фенольные соединения, встречающиеся в растительной клетке, могут оказывать разнообразное действие на токсичность количественно преобладающей феруловой кислоты. Действительно, данные, представленные в таблице 5, позволяют отметить, что.
Таблица 5
Токсичность фенольных соединений и их смесей для прорастающих у ре д оспор стеблевой ржавчины пшеницы
Соединениє % подавления прорастакня уредослор под влиянием
веществ в концентрации 5 ■ КММ вещее ти (М) в смесіг с феруловой кислотой 5- Ю-"1 М
2,5 > І0-г (5:1) 10-" (2:1) 5- 10"* (1: 1) 10-" (1:5)
Феруловая кислота. . . 44
Конифсрнловьій спирт 33 77* 74* 76* 50
Ваннлил....... 0 100* 71* _ 67*
Ванилиновая кислота. . 0 95* 75* 55* 27*
Сиреневая кислота. . 0 60* 45 49 59
Протокатеховая кислота 0 - 19* 16* 13*
Кверцетин...... 50 29 15* 28 32
* Различил между данным вариантом и чистої! феруловой кислотой достоверны при Р = 0,95.
например, коннфериловый спирт проявил аддитивность по отношению к феруловой кислоте. При добавлении других соединений,"главным образом, имеющих в бензольном кольце 4-окси, 3-метокси или 4-окси, 3,5-ди-метокси групировкн (ванилиновая н сиреневая кислоты, ванилин) отмечается определенный синергизм с феруловой кислотой. В то же время ПОлифенолы с 3,4-диокси- группировками (протокатеховая кислота, кверцетин) проявили антагонизм. Таким образом,
характер токсического действия фенольного комплекса.весьма сложен: он определяется не только концентрацией наиболее токсичных веществ, но и их соотношением с веществами, способными усиливать или ослаблять их действие.
В связи с тем, что фенольные соединения, как выяснилось, обладают довольно высокой фунгитокснчпостью, представлялось важным изучение возможности повышения устойчивости растений пшеницы путем непосредственного введения в ткани листа отдельных фенолкарбоновых кислот и их смесей.
Приведенные в таблице 6 данные позволяют отметить, что обработка листьев восприимчивого сорта растворами ФКК приводит к снижению не только степени поражения, но и одновременному изменению типа поражения растений. Так, если в контрольном варианте тип "поражения составил 3-4 балла, то в варианте с участием феруловой кислоты, и особенно ее смесей с ванилиновой и сиреневой кислотами, тип поражения приближался к 1. Данные таблицы 6 хорошо согласуются с представлением о том, что постинфекционное возрастание концентрации ФКК в листьях может быть одним из факторов, ответственных за несовместимость партнеров.
Фенольные соединения, накапливаясь в зоне внедрения патогена, могут, по-видимому, проявлять также и цитотокси-ческое действие. Поскольку первым очевидным симптомом реакции «сверхчувствительности» является распад хлорофил-
* Таблица 6
Изменение реакции растений пшеницы на заражение стеблевой ржавчиной под влиянием их обработки Ю-3 М растворами феиолкзрбоновных кислот
Интенсивность
Варианты опыта заражения Тип
число % к контролю реакции
пустул на лист *
Контроль (вода)....... 16 100 3-4
Феруловая кислота...... 10 63 1-2
Ванилиновая кислота.... 9 56 1-2
Сиреневая кислота...... II 69 2
Протокатеховая кислота, . . 13 81 3
п-кумаровая кислота..... . 13 81 2-3
п-оксибензойная кислота.... 1! 69 2-3
Феруловая+протокатеховая кисло-
ты............ 13 81 .2
Феруловая+ ваиилинова ясирене- 43
вая кислоты........ 7 1
Феруловая+ванили новая+- сирене- 56 1
ва я+протокатеховая кислоты 9
* Наименьшее существенное различие при Р=0,95 равно 3.
^__о о*-- 1 40
ли до"* ">"s w3 »w"»
»- Лол деіістши ферулово» кщштм.
*-- пои^сшен продуктаее"ошеіш.
Рис. Штті фершміі кислоти h продукта ft окисления
ла в зоне инфекции и связанное с $тим образование хлоро-тичного пятна, можно было полагать, что изменение количества хлорофилла в отрезках листьев, инкубированных на растворах ФКК, служит мерой токсичности полнфенолов для растительных клеток. Проведенное нами изучение цитотоксич-ности фенолкарбоновых кислот показало, что феруловая и сиреневая кислоты в концентрациях 4-Ю"3 М и 6-10~3 М вызывали разрушение хлорофилла в отрезках, "помещенных на растворы этих кислот, В других опытах о цитотоксическом действии ФКК судили по способности обработанных ими растительных тканей поглощать из раствора краситель - кислый фуксин. В качестве эталона токсичности был использован гербицид паракват с отчетливо выраженным некроген-ным действием по отношению к растительным тканям. Глюкоза и хлористый натрий были выбраны как заведомо нетоксичные вещества (в использованных нами концентрациях). Приведенные на рисунке 3 данные позволяют сделать вывод о том, что фенолкарбоновые кислоты проявили цитотокснче-ский эффект и в этом отношении они образовали следующий ряд: феруловая>п-кумаровая>ванилиновая.
Однако в растениях ¡n vivo фенольные соединения могут оказаться еще более токсичными. Известно, что под действием фенолокисляющих ферментов полифенолы переходят в хиноны (Стом, 1972, 1973), которые по токсичности значительно превосходят исходные фенольные соединения (Стом, 1970). Нами было изучено влияние продукта окисления фе-руловой кислоты (трансформация последней осуществлялась "пероксидазой из хрена 30 мин. в присутствии НгОг) на отрез! ки листьев пшеницы. Данные, .представленные на рисунке 4, позволяют полагать, что продукт окисления феруловой кислоты обладал более высокой цитотоксичностью по сравнению; с исходной формой этого соединения.
Таким образом, фенолкарбоновые кислоты, а также, ве-¡ роятно, и продукты их окисления, могут проявлять токсичность как для патогена, так и для самой растительной клетки.
Заключение
Нами установлено, что уже в самом начале развития возбудителя стеблевой ржавчины в тканях устойчивых растений t пшеницы возрастает активность глюкозидаз и фенилаланин-аммиак лиазы, интенсивность же связывания фенолкарбоновых кислот в виде растворимых, нерастворимых эфиров и лигнина, наоборот, снижается. Это приводит к накоплению в зараженных листьях свободных фенолкарбоновых кислот, среди которых преобладает феруловая кислота, отличающаяся заметной фунги- и цитотоксичностью.
Это накопление," конечно, происходит локально в местах контакта патогена с листьями растения, и это локальное повышение концентрации является, по всей вероятности, гораздо более значительным, чем то, которое мы обнаружили при, анализе листа в целом. Косвенным подтверждением того, что наблюдавшиеся нами изменения в фенольном комплексе листьев ассоциированы с зонами контактов, является тот факт, что развитию обширных некрозов на листьях сорта Капли предшествовало более сильное повышение концентрации свободных ФКК, чем в случае иммунного сорта Баллади 116 с его точечными некрозами.
При контакте с пероксидазной системой может иметь место образование окисленных продуктов, отличающихся более высокой фунги- и цитотоксичностью, чем исходные соединения. Такой контакт может осуществляться вследствие постинфекционных нарушений внутриклеточной компартменталнза-цин (Метлицкий, Озерцковская, 1968). Во всяком случае, несомненно, что при заражении устойчивых растений пшеницы стеблевой ржавчиной интенсивность пероксидазного окисления фенольных соединений резко возрастает (Чигрип и др., 1969).
Подтверждением наших предположений о защитных функциях фенолкарбоновых кислот являются также результаты экспериментов, в которых восприимчивые растения обрабатывали растворами этих соединений. Мы, естественно, далеки от того, чтобы связывать развитие совместимой или несовместимой реакции на заражение исключительно с особенностями изменения концентраций тех или иных фенолкарбоновых кислот. Тем не менее полученные в нашей работе данные свидетельствуют о том, что определенная связь между ранними постинокуляционными изменениями фенольного комплекса и характером реакций на заражение стеблевой-ржавчиной все же имеется.
Результаты изучения особенностей фенольного метаболизма у растений пшеницы с различной устойчивостью к стеблевой ржавчине, проведенные в 1968-1973 гг., позволяют сделать следующие основные выводы.
1. Фенолкарбоновые кислоты листьев пшеницы присутствуют главным образом в виде этанолрастворимых и этанол-нерастворимых эфиров, а также в виде гликозидов и в свободном состоянии. Общее количество всех этих форм составляет 2,2-3,2 мг/г сухого вещества. Из этого количества на долю нерастворимых и растворимых эфиров, гликозидов и свободных кислот приходится в среднем 39%, 49%. 9% и 3% и
соответственно. В последних трех фракциях обнаружены феруловая, ванилиновая, сиреневая, п-кумаровая и п-оксибен-зойная кислоты, в этанолнерастворимой-феруловая, ванилиновая и п-кумаровая,
2. При заражении устойчивых растений стеблевой ржавчиной уже в начале патогенеза (2-й день после инокуляции) заметно возрастает активность гликозидаз и фенилаланин-аммиак лиазы при одновременном снижении способности тканей листа переводить свободные фенолкарбоновые кислоты в связанное состояние. Эти изменения приводят к резкому увеличению содержания свободных фенолкарбоновых кислот, в особенности феруловой кислоты, У восприимчивых растений подобных изменений не выявлено, некоторое возрастание содержания фенолкарбоновых кислот наблюдается к 5-му дню после заражения.
3. Заражение устойчивых растений сопровождается уменьшением содержания связанных фенолкарбоновых кислот н лигнина в листьях. С другой стороны, у восприимчивых растений снижается содержание лишь растворимых фенольных соединений, а количество нерастворимых эфиров фенолкарбоновых кислот даже несколько возрастает,
4. Инфицирование растений пшеницы уредоспорами стеблевой ржавчиЕШ сказывается также на фенольном обмене корней. При этом происходящие в корнях изменения противоположны тем, которые характерны для зараженных листьев: содержаниецсвободных фенолкарбоновых кислот и их нерастворимых эфиров здесь существенно возрастает. Указанные процессы более ярко выражены в устойчивых растениях, нежели в восприимчивых.
5. Установлена высокая токсичность феруловой кислоты для прорастающих уредоспор патогена. Ванилиновая и сиреневая кислоты, будучи нетоксичными для уредоспор, при совместном применении с феруловой кислотой достоверно усиливал]! токсическое действие последней. Феруловая кислота оказалась также наиболее токсичной для тканей листьев пшеницы, причем окисление ее в течение 30 мин. "пероксндазой повышало цнтотокснчность (способ образования еще более токсичного продукта),
6. Обработка зараженных восприимчивых растений раствором феруловой кислоты и особенно ее смесью с ванилиновой и сиреневой не только достоверно снижала интенсивность заражения, но изменяла и тип реакции, приближая его к типу, характерному для устойчивых растений. Полученные данные позволяют считать, что локальное накопление фенолкарбоновых кислот в зоне развития патогена может быть одной из причин некротизации клеток н гибели патогена в тканях устойчивых растений.
1. Изменения фенольного обмена у яровой пшеницы при заражении стеблевой ржавчиной. Физиология растений, 1969 (16), 2, 330-335 (в соавторстве с В. В. Чигриным).
2. Токсичность фенольных соединений для прорастающих уредоспор стеблевой ржавчины пшеницы Puccinia graminis Pers f. sp. tritici Eriks, et Henn. Микология и фитопатология, 1969, 3 (3), 243-248 (в соавторстве с В. В. Чигриным и Л. М. Бессмельцевой).
3. Некоторые особенности фенольного обмена у сортов пшеницы с различной устойчивостью к стеблевой ржавчине. Тезисы Второго Всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям. Алма-Ата, 1970, 106 (в соавторстве с В. В. Чигриным).
4. Фенолкарбоновые кислоты и лигнин в листьях устойчивых и восприимчивых сортов яровой пшеницы при заражении стеблевой ржавчиной. Физиология растеннй, 1973, 20, вьш, 5, 942-948 (в соавторстве с В. В, Чигриным, Н. М. За-прометовым).
5. Некоторые особенности фенольного обмена пшеницы и устойчивость к стеблевой ржавчине. Тезисы Третьего Всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям. Тбилиси, 1976 (в соавторстве с В. В. Чигриным, М, Н. Запрометовым).
Л 77690 1/1V-77 г. Объем ] п. л. Заказ 745.
Типография Московской с.-х. академии им. К- А. Тимирязева 125008, Москва А-8, Тимирязевская ул., 44
Островская А.М.
Белорусский государственный университет,
Минск, Беларусь.
Молодой ученый.
Научный руководитель: Бирюкова Н.М.
Определение содержания биофлавоноидов в растительном материале часто может быть сопряжено с определёнными трудностями. В зависимости от поставленных задач необходимо применение различных подходов на стадиях изучения состава лекарственного растительного сырья и его стандартизации, на этапе разработки состава новых препаратов, а также на всех стадиях технологического процесса производства готовых лекарственных форм. Целью данной работы был анализ биофлавоноидов и фенолкарбоновых кислот в лекарственном растительном сырье (ЛРС) с применением физико-химических методов анализа, таких как бумажная хроматография и спектрофотометрия, наиболее часто применяемых в анализе ЛРС, а также оценка возможности применения метода ВЭЖХ для решения поставленной задачи. В качестве объектов исследования были выбраны Bupleurum aureum (володушка золотистая) и Bupleurum rotungifolium L. (володушка крупнолистная). Данная работа является частью проводимых в НИИ ФХП БГУ совместно с ГНУ «Центральный ботанический сад НАН Беларуси» исследований по созданию новых отечественных фитопрепаратов для отоларингологии, офтальмологии и стоматологии на основе ЛРС.
Химический анализ образцов на содержание отдельных групп фенольных соединений проводился с использованием следующих методов: суммарное количество антоциановых пигментов – по методу ; суммарное количество катехинов – по методу с использованием ванилинового реактива; суммарное количество флавонолов – по методу , модифицированному ; суммарное количество фенолкарбоновых кислот – по методу (табл. 1).
Таблица 1. Содержание отдельных групп фенольных соединений в образцах володушки золотистой (образец №1) и володушки крупнолистной (образец №2).
Методом ВЭЖХ проводилась качественная и количественная идентификация состава агликонов флавоноидов и хлорогеновой кислоты . В ходе исследования были подобраны оптимальные условия проведения анализа и достигнута высокая степень воспроизводимости результатов. Идентификация проводилась путём сопоставление времен удерживания сигналов веществ на хроматограммах анализируемых образцов со временем удержания сигналов стандартных образцов флавоноидов, а также по анализу УФ-спектров. Было достоверно идентифицировано четыре агликона флавонолов: кверцетрин (Rt = 4,977 мин), кверцетин (Rt = 7,34 мин), кемпферол (Rt = 12,509 мин), изорамнетин (Rt = 14,007 мин), а также хлорогеновая кислота (Rt = 4,204 мин). В УФ спектрах поглощения присутствовали полосы поглощения с λмакс.= 260 и 362 нм, характерные для кверцетрина; λмакс.=257 и 375 нм – для кверцетина; λмакс.= 218, 253, 266, 294, 322, 367 нм – для кемпферола; λмакс.= 253, 370 нм – для изорамнетина; λмакс.= 221, 247 и 370 нм – для хлорогеновой кислоты. Хроматограммы обоих образцов характеризовались одним и тем же флавоноидным составом, что свидетельствует в пользу того, что данные образцы относятся к одному виду Bupleurum. По площадям пиков было рассчитано количественное содержание кверцетина, кверцетрина, кемпферола, изорамнетина и хлорогеновой кислоты в обоих образцах. Максимальным было содержание кверцетина (1,16±0,01 и 0,45±0,02 для образцов №1 и №2 соответственно), а минимальным – содержание кверцетрина (0,28±0,01 и 0,17±0,01 для образцов №1 и №2 соответственно). Данные ВЭЖХ анализа позволили достоверно идентифицировать индивидуальные полифенольные соединения и установить их количественное содержание, что имеет большое значение на стадии детального изучения ЛРС и установления возможности включения его в состав лекарственных препаратов.
В данной работе для анализа одного и того же объекта были применены различные физико-химические методы анализа, которые позволили получить взаимодополняющую информацию об объекте исследования. Таким образом, при стандартизации данного ЛРС и на различных стадиях производственного процесса может быть применён один из вышеописанных физико-химических методов или же их комбинация в зависимости от поставленной аналитической задачи.
