Изучение подавления активности ферментов служит одним из способов расшифровки механизма их действия. Подходом к решению последней задачи является изучение специфичности действия ферментов. В свою очередь, это требует корректного измерения кинетических параметров в присутствии изучаемого аналога субстрата. Рассмотрим способы определения характера взаимоотношений субстратов, их аналогов и ингибиторов ферментативной активности путем вычисления ряда кинетических параметров.
При этом, если константа диссоциации комплекса K s = K m равна:
Ингибиторы ферментов можно разделить на две основные группы: обратимые и необратимые. После удаления ингибитора первого типа активность фермента восстанавливается; во втором случае ингибитор удалить не удается или активность фермента не восстанавливается даже после удаления ингибитора. Необратимое ингибирование достигает максимума, когда весь фермент связан с ингибитором. Обратимое ингибирование достигает состояния равновесия, положение которого определяется константой ингибирования , характеризующей сродство фермента к ингибитору. Схема обратимого ингибирования приведена ниже:
При конкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с одним и тем же активным центром фермента. В присутствии ингибитора снижается сродство фермента к субстрату. Величина не изменяется, так как при «насыщающей» концентрации субстрат вытесняет ингибитор из комплекса с ферментом.
При неконкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с разными центрами фермента. При этом величина К га не изменяется, а величина V max снижается.
Возможны также промежуточные или альтернативные случаи, например, когда ингибитор связывается не с ферментом, а с фермент-субстратным комплексом, как в случае бесконкурентного ингибирования, при котором изменяются оба кинетических параметра.
Для определения типа ингибирования обычно используют график Лайнуивера-Берка, полученный для данного субстрата в отсутствие и в присутствии ингибитора.
При конкурентном ингибировании, если определена величина К т в присутствии ингибитора, можно рассчитать константу ингибирования по следующей формуле:
При неконкурентном ингибировании с помощью определения измененной величины V можно рассчитать К. по следующей формуле:
Все биохимические процессы в клетке взаимосвязаны и взаимозависимы, тем не менее часть из них преимущественно выполняет функцию построения клеточного материала, а часть - снабжения источниками энергии этих «строительных работ». Поэтому принято разделять биохимические процессы на два основных типа: ассимиляционные, называемые анаболизмом, включающим синтез низкомолекулярных предшественников и построения из них молекул биополимеров, и диссимиляционные, называемые катаболизмом, состоящим в обеспечение источника энергии, «энергетического привода», приводящего в движение анаболизм.
Рассмотрим основные механизмы процессов трансформации энергии в клетке, т.е. механизмы катаболических процессов.
Различают обратимое и необратимое ингибирование. Если ингибитор вызывает стойкие изменения пространственной третичной структуры молекулы фермента или модификацию функциональных групп фермента, то такой тип ингибирования называется необратимым. Чаще, однако, имеет место обратимое ингибирование, поддающееся количественному изучению на основе уравнения Михаэлиса-Ментен. Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют на конкурентное и неконкурентное в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата.
Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, имеющими структуру, похожую на структурусубстрата, но несколько отличающуюся от структуры истинного субстрата. Такое ингибирование основано на связывании ингибитора с субстратсвязывающим (активным) центром. Классическим примером подобного типа ингибирования является торможение сукцинатдегидрогеназы (СДГ) малоновой кислотой. Этот ферменткатализирует окисление путем дегидрирования янтарной кислоты (сукцината) в фумаровую:
Если в среду добавить малонат (ингибитор), то в результате структурного сходства его с истиннымсубстратом сукцинатом (наличие двух таких же ионизированных карбоксильных групп) он будет взаимодействовать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса, однако при этом полностью исключается перенос атома водорода от малоната. Структуры субстрата (сукцинат) и ингибитора(малонат) все же несколько различаются. Поэтому они конкурируют за связывание с активным центром, и степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Таким образом, ингибитор может обратимо связываться сферментом, образуя фермент-ингибиторный комплекс. Этот тип ингиби-рования иногда называют ингибированием по типу метаболического антагонизма (рис. 4.20).
В общей форме реакция взаимодействия ингибитора с ферментом может быть представлена следующим уравнением:
Образовавшийся комплекс, называемый фермент-ингибиторным комплексом ЕI, в отличие от фермент-субстратного комплекса ES не распадается с образованием продуктов реакции. Константу диссоциациикомплекса EI, или ингибиторную константу К i , можно, следуя теории Михаэлиса–Мен-тен, определить как отношение констант обратной и прямой реакций:
Метод конкурентного торможения нашел широкое применение в медицинской практике. Известно, например, что для лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, применяютсульфаниламидные препараты. Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство спарааминобензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являющейся составной частью
Рис. 4.20. Действие конкурентного ингибитора (схема по В.Л. Кретовичу). Е - фермент; S - субстрат; Р 1 и Р 2 - продукты реакции; I - ингибитор.
ферментов бактерий. Благодаря этому структурному сходству сульфаниламид блокирует действие ферментапутем вытеснения парааминобензой-ной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий.
Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента. Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент. При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение становится необратимым. Примером необратимого ингибирования является действие йодацетата, ДФФ, а также диэтил-n-нитрофенилфосфата и солей синильной кислоты. Это действие заключается в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов и молекулефермента.
Ограниченный протеолиз.
Регуляция активности с помощью гормонов.
Гормональная регуляция осуществляется на генетическом уровне путём обратимого фосфорилирования. Например, под действием адреналина происходит активация процесса распада гликогена. В ходе этого процесса образуется небелковое соединения – у-АМФ. у-АМФ – внутриклеточный гормон (вторичный посредник) является аллостерическим регулятором большого числа протеинлипаз. у-АМФ образуется из АТФ под действием аденилатциклаз.
Регуляция активности путём химической модификации.
Химическая модификация - присоединение каких-либо функциональных групп к ферменту, с последующим изменением его активности. Химическая модификация обратима. Так например, ключевые ферменты энергетического обмена - фосфорилаза, гликогенсинтаза контролируются путём фосфорилирования и дефосфорилирования, осуществляемого специфическими ферментами - протеинилазой и фософотазой. И уровень активности ключевых ферментов будет определятся соотношением фосфорилированных и дефосфорилированных форм этих ферментов.
Все ферменты ЖКТ и поджелудочной железы синтезируются в неактивной форме в виде проферментов. Регуляция в этом случае сводится к превращению их в активную форму. Так, например, активация трипсиногена идёт под действием энтерокиназы и ведёт к отщеплению избыточной последовательности аминокислот. При этом происходит формирование активного центра и третичной структуры трипсина. Это явление получило название ограниченный протеолиз . Его биологическое значение заключается в том, что он исключает самопереваривание органа (аутокатализ), что, например, происходит при активации трипсина в самой поджелудочной железе. Во-вторых, обеспечивается более тонкая регуляция количества фермента.
Ограниченный протеолиз находится под контролем факторов среды, рН, в клетке – под контролем Са.
Скорость ферментативной реакции определяется присутствием в среде эффекторов: активаторов и ингибиторов. Активаторы повышают скорость реакции и иногда модифицируют её, а ингибиторы - тормозят её.
Активаторы: коферменты, ионы Ме, SH- реагенты. Активизирующее влияние связано с оптимизацией структуры белковой молекулы и активного центра фермента. Это улучшает взаимодействие фермента и субстрата.
Активатор панкреатической липазы – желчные кислоты.
Активатор трипсиногена – энтерокиназы.
Активатор хематрипсиногена – трипсин.
Активатор пепсина и амилазы – ионы Са.
В качестве активаторов могут выступать и Ме:
Zn – активатор угольной ангидразы.
Ингибиторами принято называть вещества, вызывающее частичное или полное торможение реакции.
Любые агенты, вызывающие денатурацию фермента, являются ингибиторами. Однако такое ингибирование неспецифично потому, что не связано с механизмом действия ферментов. Гораздо больше специфических ингибиторов, которые оказывают действия на один какой – либо фермент или на группу родственных ферментов. Такие ингибиторы могут дать ценную информацию о природе активного центра фермента. На ингибировании ферментов основан механизм действия многих токсинов и ядов на организм. Так, при отравлении синильной кислотой спазм наступает вследствие полного торможения дыхательных ферментов (цитохромоксидазы).
Типы ингибирования :
1) Обратимое
2) Необратимое
Если молекула ингибитора вызывает стойкие изменения или модификацию активного центра фермента, то такой тип ингибирования называется необратимым .
Обратимое ингибирование встречается чаще, и его делят на конкурентное и неконкурентное , в зависимости от того удаётся или не удаётся преодолеть торможение ферментативной реакции путём повышения {S}. Конкурентное ингибирование возможно при наличии структурного сходства субстрата и ингибитора. Например, торможение активности сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой:
НООС - 2Н НООС
СН -------- СН
СН СДГ СН
НООС НООС
сукцинат фумарат
Если в среду вместо сукцината внести малонат, то в силу его структурного сходства с сукцинатом он будет реагировать с активным центром СДГ. Однако при этом перенос 2Н от малоната не происходит, так как структуры малоната и сукцината всё же несколько отличаются и они будут конкурировать за связывание с активным центром СДГ и степень торможения будет определена соотношением концентраций малоната и сукцината. Особенность этого ингибирования – обратимость за счёт увеличения {S}.
I(+) E + I ------ EI
Часто имеет место частично неконкурентное ингибирование, при котором снижение Vmax сочетается с повышением Km. В редких случаях степень торможения активности фермента может повышаться с повышением {S}. Это так называемое бесконкурентное ингибирование . В этом случае возможно соединение ингибитора с комплексом ES, следовательно, образуется неактивный или медленно реагирующий комплекс
ES + I ------ ESI
Действие многих лекарств основано как раз на этих всех методах ингибирования. Так, например, сульфаниламидные препараты применяются для лечения некоторых инфекций, которые имеют структурное сходство с ПАБК, которую бактериальная клетка использует в каестве субстрата для синтеза фолиевой кислоты. Благодаря сходству сульфаниламид блокирует действие фермента путём вытеснения ПАБК из комплекса ES , что ведёт к снижению роста бактерий. Это конкурентное ингибирование .
Все биохимические реакции, протекающие в организме, подвержены специфическому контролю, который осуществляется через активирующее или ингибирующее воздействие на регуляторные ферменты. Последние обычно находятся в начале цепочек метаболических превращений и либо запускают многоэтапный процесс, либо тормозят его. Регулированию также подвергаются некоторые единичные реакции. Конкурентное ингибирование является одним из основных механизмов контроля каталитической активности ферментов.
Механизм ферментативного катализа основан на связывании активного центра энзима с молекулой субстрата (комплекс ES), в результате чего происходит химическая реакция с образованием и освобождением продукта (E+S = ES = EP = E+P).
Ингибированием фермента называют снижение скорости или полную остановку процесса катализа. В более узком смысле под этим термином подразумевают уменьшение сродства активного центра к субстрату, что достигается путем связывания молекул энзимов с веществами-ингибиторами. Последние могут действовать различными способами, на основании чего поделены на несколько типов, которым соответствуют одноименные механизмы ингибирования.
Основные типы ингибирования
По характеру протекания процесса ингибирование бывает двух видов:
- Необратимое - вызывает стойкие изменения в молекуле фермента, лишающие ее функциональной активности (последняя не подлежит восстановлению). Оно может иметь как специфический, так и неспецифический характер. Ингибитор прочно связывается с энзимом путем ковалентного взаимодействия.
- Обратимое - основной вид негативной регуляции ферментов. Осуществляется за счет обратимого специфического присоединения ингибитора к белку-энзиму слабыми нековалентными связями, поддается кинетическому описанию по уравнению Михаэлиса-Ментен (исключение составляет аллостерическая регуляция).
Выделяют два основных типа обратимого ингибирования ферментов: конкурентное (может быть ослаблено увеличением концентрации субстрата) и неконкурентное. В последнем случае происходит снижение максимально возможной скорости катализа.
Основная разница между конкурентным и неконкурентным ингибированием заключается в месте присоединения регуляторного вещества к ферменту. В первом случае ингибитор связывается непосредственно с активным центром, а во втором - с другим участком энзима, либо с фермент-субстратным комплексом.
Существует также смешанный тип ингибирования, при котором связывание с ингибитором не предотвращает образование ES, но замедляет катализ. В этом случае вещество-регулятор находится в составе двойных или тройных комплексов (EI и EIS). При бесконкурентном типе фермент связывается только с ES.
Особенности обратимого конкурентного ингибирования ферментов
Конкурентный механизм ингибирования основан на структурном сходстве регуляторного вещества с субстратом. В результате образуется комплекс активного центра с ингибитором, условно обозначаемый как EI.
Обратимое конкурентное ингибирование имеет следующие особенности:
- связывание с ингибитором происходит в активном центре;
- инактивация молекулы фермента обратима;
- ингибирующий эффект может быть уменьшен увеличением концентрации субстрата;
- ингибитор не влияет на максимальную скорость ферментативного катализа;
- комплекс EI может распадаться, что характеризуется соответствующей константой диссоциации.
При таком типе регуляции ингибитор и субстрат как бы соперничают (конкурируют) друг с другом за место в активном центре, откуда и произошло название процесса.
В итоге конкурентное ингибирование можно определить как обратимый процесс торможения ферментативного катализа, основанный на специфическом сродстве активного центра к веществу-ингибитору.
Механизм действия
Связывание ингибитора с активным центром препятствует образованию фермент-субстратного комплекса, необходимого для осуществления катализа. В итоге молекула энзима становится неактивной. Тем не менее каталитический центр может связаться не только с ингибитором, но и с субстратом. Вероятность образования того или иного комплекса зависит от соотношения концентраций. Если молекул субстрата значительно больше, то фермент будет реагировать с ними чаще, чем с ингибитором.
Влияние на скорость химической реакции
Степень торможения катализа при конкурентном ингибировании определяется тем, какое количество фермента будут образовывать EI-комплексы. При этом можно увеличить концентрацию субстрата до такой степени, что роль ингибитора будет вытеснена, а скорость катализа достигнет максимально возможного значения, соответствующего величине V max по уравнению Михаэлиса-Ментен.
Такое явление объясняется сильным разбавлением ингибитора. Как следствие, вероятность связывания с ним молекул фермента сводится к нулю, а активные центры реагируют только с субстратом.
Кинетические зависимости ферментативной реакции при участии конкурентного ингибитора
Конкурентное ингибирование увеличивает константу Михаэлиса (K m), которая равна концентрации субстрата, необходимой для достижения ½ максимальной скорости катализа в начале реакции. Количество фермента, гипотетически способного связаться с субстратом, остается постоянным, а число фактически образующихся ES-комплексов зависит только от концентрации последнего (комплексы EI не постоянны и могут быть вытеснены субстратом).
Конкурентное ингибирование ферментов легко определить по графикам кинетической зависимости, построенным для разных концентраций субстрата. В этом случае величина K m будет меняться, а V max оставаться постоянной величиной.
При неконкурентном ингибировании все наоборот: ингибитор связывается вне активного центра и присутствие субстрата никак не может на это повлиять. В результате часть молекул фермента «выключается» из катализа, и максимально возможная скорость снижается. Тем не менее активные молекулы энзима могут беспрепятственно связываться с субстратом как при маленькой, так и при высокой концентрации последнего. Следовательно, константа Михаэлиса остается постоянной.
Графики конкурентного ингибирования в системе двойных обратных координат представляют собой несколько прямых, пересекающих ось ординат в точке 1/V max . Каждая прямая соответствует определенной концентрации субстрата. Разные точки пересечения с осью абсцисс (1/[S]) говорят об изменении константы Михаэлиса.
Действие конкурентного ингибитора на примере малоната
Типичным примером конкурентного ингибирования является процесс снижения активности сукцинатдегидрогиназы — фермента, катализирующего окисление янтарной кислоты (сукцината) в фумаровую. В роли ингибитора здесь выступает малонат, имеющий структурное сходство с сукцинатом.
Добавление ингибитора в среду вызывает образование комплексов малоната с сукцинатдегидрогиназой. Такая связь не вызывает повреждения активного центра, но блокирует его доступность для янтарной кислоты. Увеличение концентрации сукцината снижает ингибирующий эффект.
Использование в медицине
На механизме конкурентного ингибирования основано действие многих лекарственных препаратов, представляющих собой структурные аналоги субстратов некоторых метаболических путей, торможение которых является необходимой частью лечения заболеваний.
Например, для улучшения проводимости нервных импульсов при мышечных дистрофиях требуется повысить уровень ацетилхолина. Это достигается угнетением активности гидролизующей его ацетилхолинэстеразы. В роли ингибиторов выступают четвертичные аммониевые основания, входящие в состав лекарственных препаратов (прорезин, эндрофоний и т. д.).
В особую группу выделяют антиметаболиты, которые помимо ингибирующего действия проявляют свойства псевдосубстрата. В таком случае формирование комплекса EI приводит к образованию биологически инертного аномального продукта. К антиметаболитам относят сульфаниламиды (используются при лечении бактериальных инфекций), аналоги нуклеотидов (применяются для остановки клеточного роста раковой опухоли) и т. д.
Конкурентное ингибирование: определение, особенности и примеры — все о путешествиях на сайт
При определенных условиях ингибитор может быть легко отделен от фермента.
Конкурентное обратимое ингибирование
В этом случае вещество, по своей структуре близкое к обычному субстрату фермента, соединяется с активным центром фермента, но не может прореагировать с ним. Находясь здесь, оно преграждает доступ к активному центру любой молекуле настоящего субстрата. Поскольку в этом случае ингибитор и субстрат конкурируют за место на активном центре фермента, эту форму ингибирования называют конкурентным ингибированием . Оно обратимо, так как при увеличении концентрации субстрата скорость реакции возрастает.
6.4. Почему при этих условиях скорость реакции возрастет?
Рис. 6.15 иллюстрирует один из примеров конкурентного ингибирования.
Явление конкурентного ингибирования используется в химиотерапии . Цель химиотерапии - уничтожить при помощи тех или иных химических препаратов возбудителя болезни, не повреждая при этом ткани организма-хозяина. Во время второй мировой войны для борьбы с инфекционными заболеваниями широко применялись сульфаниламидные препараты , или сульфаниламиды , - производные сульфаниловой кислоты. Сульфаниламиды по своей химической структуре близки к парааминобензойной кислоте (ПАБК) - необходимому фактору роста многих патогенных бактерий. ПАБК требуется бактериям для синтеза фолиевой кислоты, которая служит у них кофактором фермента. Действие сульфаниламидов связано с нарушением синтеза фолиевой кислоты из ПАБК.
Животные клетки не чувствительны к сульфаниламидам, хотя им для некоторых реакций и требуется фолиевая кислота. Объясняется это тем, что они используют преобразованную фолиевую кислоту; метаболический путь, который обеспечивал бы ее синтез, у животных отсутствует.
Неконкурентное обратимое ингибирование
Ингибиторы этого рода не родственны по своей структуре субстрату данного фермента; в образовании комплекса с ингибитором участвует в этом случае не активный центр фермента, а какая-нибудь другая часть его молекулы (рис. 6.16). Образование комплекса влечет за собой изменение глобулярной структуры фермента, и, хотя настоящий субстрат при этом к ферменту все же присоединяется, катализ тем не менее оказывается невозможным. В качестве примера можно привести цианид. Он связывается с ионами металлов, выполняющими у некоторых ферментов роль простетической группы (в частности, с ионами меди цитохромоксидазы), и подавляет активность этих ферментов. С повышением концентрации ингибитора скорость ферментативной реакции все более снижается. К моменту насыщения ингибитором она оказывается практически равной нулю.
