С помощью световой микроскопии в растительной клетке. Методы изучения растительной клетки. Уход за микроскопом

Методы световой и электронной микроскопии

1. Световая микроскопия

световой электронный микроскоп интерференция

Световой микроскоп может повысить разрешающую способность человеческого глаза примерно в 1000 раз. Это является "полезным" увеличением микроскопа. При использовании видимой части спектра света конченый предел разрешения светового микроскопа составляет 0,2-0,3 мкм. Далее будут рассмотрены методы световой микроскопии.

1 Метод темного поля (ультрамикроскопии)

Метод тёмного поля в проходящем свете основан на эффекте Тиндаля, так как подобна частичкам пыли с луче света, при боковом освещениии светятся мельчайшие частицы, отраженный свет от которых попадает в объектив микроскопа. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат не попадает в объектив. Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света.

В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип - препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения. При этом методе можно обнаружить чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных микроскопов. При помощи иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате частиц размером до 210-9 м. Но форму и точные размеры этих частиц с помощью этого метода определить невозможно. Ультрамикроскопы применяются в основном в коллоидной химии.

2 Метод светлого поля и его разновидности

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них поглощающими свет частицами и деталями. В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения.

Метод косого освещения - разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения, это помогает выявить "рельефность" объекта за счёт образования теней.

Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов. Освещение производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

1.3 Метод фазово-контрастной микроскопии

Большая часть клеточных структур мало отличается коэффициентом преломления света, поглощения лучей друг от друга и среды. Для того, чтобы изучить такие компоненты приходится изменять освещенность(с потерей четкости изображения) или применять особые методы и приборы. Метод фазово-контрастной микроскопии является одним из таких. Его широко применяют при витальном изучении клеток. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе. Невидимые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости, которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. В получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным. Объекты могут выглядеть темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

4 Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия)

Метод интерференционного контраста сходен с предыдущим - они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Пучок параллельных световых лучей от осветителя раздваивается на два потока, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу и приобретает изменения в фазе колебания, другой - мимо минуя объект по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта.

5 Поляризационная микроскопия

Поляризационная микроскопия - это метод наблюдения в поляризованном свете за объектами, обладающими изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц. Перед конденсором поляризационного микроскопа помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Если анализатор повернуть затем на 90о по отношению к первой, то свет проходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.

6 Витальное изучение клеток

Методы световой микроскопии дают нам возможность наблюдать живые клетки. Для короткого наблюдения клетки обычно помещают в жидкую среду на предметное стекло. Но для более длительного времени нужны другие способы. Часто для длительного наблюдения используют специальные камеры (плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкими стеклами, или разборные плоские камеры). Клетки изучают в специально подобранных для них средах. Обычно для простейших это сбалансированные солевые растворы с добавками микроорганизмов и других простейших, служащих для объекта изучения пищей. Свободные клетки многоклеточных могут изучаться в плазме крови или в специальных синтетических средах. Для изучение клеток и тканей животных используют метод клеточных культур.

Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) искусственно выращиваются в контролируемых условиях для дальнейшего изучения. Более простой вариант этого метода представляет собой то, что в камеру с питательным раствором помещается небольшой кусочек живой ткани и через некоторое время по периферии начинает идти рост и деление клеток. Второй способ получения культуры клеток это обработка кусочка ткани трипсином или хелатоном (что приведет к диссоциации клеток), а затем помещение в сосуд с питательным экстрактом, где, после опущения клеток на дно и их прикрепления, начинается рост и размножение культуры. Для культуры клеток предпочитают использовать эмбриональный материал, который обладает большей способностью к делению чем взрослый. При культуре клеток следует соблюдать специальные условия стерильности, температурного режима, pH. Таким же методом можно культивировать клетки растительного происхождения. Для этого их обрабатывают ферментами, растворяющими клеточные оболочки, а отделившееся содержимое помещают в специальную среду, где происходит их рост и деление. Вместе с культивированием клеток обычно используют микрокиносъемку и микрофотосъемку, с помощью которой регистрируются многие клеточные процессы.

6.2 Метод микрохирургии

Метод микрохирургии применяется для исследования живых клеток. Это метод оперативного вмешательства и воздействия на клетку, в т.ч. удаление или вживление отдельных органелл. Этот метод также предусматривает пересадку органелл из клетки в клетку, введение крупных макромолекул в клетку. Обычно микроманипулятор совмещается с микроскопом, который служит для наблюдения за ходом оперативного вмешательства. Микрохирургическими инструментами являются стеклянные крючки, иглы, капилляры, которые изготавливаются на "микрокузницах". При микрооперациях клетку помещают в специальную камеру, куда также вводят инструменты. В последнее время также широко используются лазерные микропучки и микропучки UV спектра. Их применяют для точечного поражения клетки в ходе исследования.

6.3 Метод флуоресцентной микроскопии

Метод получения увеличенного изображения с использованием свечения возбуждённых атомов и молекул образца. В флуоресцентном микроскопе образец облучается светом с большей частотой, а изображение получают в оптическом спектре. Изображение флуоресцентного препарата может сфотографировано специализированной цифровой камерой, позволяющей делать снимки с большой выдержкой. Довольно часто используются вещества способные к флуоресценции или же в клетку инъецируются флуоресцентные агенты

Одним из видов флуоресцентной микроскопии является конфокальная микроскопия - метод, позволяющий получать изображения с некоторой глубины в середине образца.

1.6.4 Метод конфокальной сканирующей световой микроскопии

Конфокальный световой сканирующий микроскоп используют для получения трехмерной реконструкции объекта. С его помощью получают серию последовательных срезов клетки, взятой с различной глубины. После этого специальная компьютерная программа сводит эти изображения воедино и мы можем получить объемное, трехмерное изображение объекта.

7 Изучение фиксированных клеток

Многие данные об устройстве и функционировании клетки были получены именно на фиксированных клетках. Фиксация - сложный процесс, направленный на убийство клетки, прекращение активности клеточных ферментов, распада компонентов, избежание потери структур и веществ, а также их приобретения, если они отсутствовали в живой клетке. Но, к сожалению, еще не существует фиксатора, который бы удовлетворял всем этим требованиям.

7.1 Методы цитохимического анализа

Это ряд приемов окрашивания, главной целью которого является выявление специфических химических веществ клетки. Существует целый ряд приемов окрашивания, прямо выявляющие те или иные вещества. К таким цитохимическим реакциям предъявляют требования: специфичность связывания красителя, неизменность локализации вещества. Пример такой реакции это реакция на ДНК - Фёльгена.

7.2 Метод цитофотометрии

Данный метод позволяет количественно измерить конечный продукт цитохимической реакции. Он основывается на определении кол-ва веществ по поглощению ими света определенной волны. Интенсивность поглощения лучей пропорциональна концентрации вещества при одной и той же толщине объекта. Для этого метода используют микроскопы-цитофотометры (за их объективами расположен чувствительный фотометр). Этот метод широко используется при определении количества ДНК после реакции Фёльгена. Также можно провести количественную оценку не только поглощающих свет веществ, но и его излучающих. На этом основывается флуорометрия.

7.3 Метод иммунохимического исследования (иммунохимическиереакции с использованием флуоресцентных антител)

Метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Существуют методы прямой и непрямой иммунофлуоресценции, в первом случае антиген связывается с антителом, конъюгированным с флуоресцентной меткой (флуорохромом, например, FITС или TRITC, во втором же антиген связывается с неконъюгированным специфическим антителом (первичным антителом). Флуоресцентная метка конъюгирована со вторичным антителом, специфичным к Fc-фрагменту первичного антитела. Непрямой метод более чувствителен, чем прямой метод. По свечению флуорохрома находят места локализации искомых белков в клетке. Но для того, чтобы меченные антитела проникли в клетку нужно сделать мембрану более проницаемой. Обычно это достигается фиксацией клеток и частичной экстракцией липидов из мембран.

7.4 Метод радиоавтографии

Данный метод используется для обнаружения локализации мест синтеза биополимеров, определения путей переноса веществ в клетке, наблюдения за миграцией или свойствами клеток. Для этого применяют регистрацию веществ, меченных изотопами. Способ повторяет метод Беккереля. В среду с клетками вводится предшественник одного из веществ, в котором один из атомов замещен а радиоактивный изотоп. В процессе синтеза меченный атом попадет в саму молекулу и ее можно будет зарегистрировать с помощью фотоэмульсии. Точность этого метода зависит от величины зерна AgBr и от энергии частицы. Поэтому для метода радиоавтографии используют специальную мелкозернистую фотоэмульсию и изотопы с малой энергией. Радиоавтографически нельзя изучать растворимые в воде соединения, так как атомы могут потеряться.

7.5 Метод молекулярной гибридизации

Применение предыдущего метода совместно с методом радиоавтографии дает нам возможность локализовать на хромосоме места с определенной нуклеотидной последовательностью или даже расположение определенных генов. Для этого раствор с меченой нуклеиновой кислотой наносят на препарат с денатурированной ДНК в составе хромосом или ядер. В процессе ренатурации ДНК образуется гибрид меченной нуклеиновой кислоты и комплементарным участком исходной ДНК. Место такой связи регистрируется радиоавтографически. Также метод применяется при окраске нуклеиновой кислоты флуорохромами. Это значит, что мы можем определить положение любой последовательности ДНК.

Поскольку вопрос повышения разрешения всегда стоял остро, ученые пришли к выводу, что в световой микроскопии повысить разрешение можно только за счет использования источника света, который испускает волны с наименьшей длинной. Таким источником может быть раскаленная нить, выбрасывающая поток электронов, который можно сфокусировать, пропуская через магнитное поле. На основе этого был создан световой микроскоп. В настоящее время различают просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ) и растровую электронную микроскопию (РЭМ). Далее будут рассмотрены методы электронной микроскопии.

1 Контрастирование корпускулярных объектов

Существует несколько методов контрастирования. Я рассмотрю два из них: негативное контрастирование и оттенение металлами. Негативное контрастирование производят с помощью ФВК, молибденовоскислого аммония, уранилацетата. после нанесения раствора на исследуемый объект, затем нанести на пленки-подложки и высушить, то исследуемый объект будет погружен в аморфное вещество высокой плотности. Это приведет к тому, что на снимках они будут выглядеть как белые объекты на темном фоне. Растворы могут также проникать вглубь исследуемого объекта и выявлять скрытые структуры. Также существует метод позитивного контраста. В этом случае используются соли тяжелых металлов, которые повышают электронную плотность объекта, таким образом, контраст его повышается. Оттенение металлами - при термическом испарении металлов их частицы разлетаются и осаждаются на исследуемом объекте в виде слоя, чья толщина варьируется в зависимости от направления полета частиц. В местах, где экранирует пучок частиц, пространство будет темнее.

2.2 Ультрамикротомия

Ультрамикротомия представляет собой совокупность приемов для получения сверхтонких срезов с помощью ультратомов, или ультрамикротомов. Ультрамикротомы - аппараты для автоматического приготовления сверхтонких срезов тканей запрограммированной толщины (5-10 нм). Это нужно, потому что пучок электронов, проходя через более толстые объекты, поглощается, вызывает нагревание и приводит к деформации препарата. Процедура их довольна схожа с аналогичной для световой микроскопии. Сначала клетки фиксируют, часто используют ГА (глутаровый альдегид), а затем OsO4, хотя бывает и применение их по отдельности. Затем осуществляют проводку с последним этапом - погружением в ксилол. После препарат заливают эпоксидными смолами (эпон). Теперь препарат, заключенный в твердые блоки можно резать с помощью стеклянных или алмазных ножей для изготовления срезов настолько малой величины используют термическую подачу объекта. Затем идет окраска препарата, обычно уранилацетатом и нитратом свинца, которые контрастируют позитивно. Эта техника изготовления открыла огромные возможности для применения электронной микроскопии почти во всех областях биологии и медицины.

Возможно проводить исследование методом радиоавтографии с использованием сверхтонкозернистых эмульсий и огромных экспозиций. А также исследований без фиксации и заключения в эпон методом криоультрамикротомии. В этом случае объект моментально замораживают до температуры жидкого азота, вода переходит в стекловидное состояние, а процессы моментально тормозятся. Полученные таким образом срезы используют в иммунохимических исследований и т.д.

Для изучения структуры мембранных компонентов используют метод замораживания-скалывания. Метод похож на предыдущий: объект моментально охлаждается до температуры жидкого азота, а затем скалывается охлажденным ножом. Поверхность слоя покрывают слоем металла и углерода, а затем растворяют объект и получают реплику с поверхности скола. При этом можно исследовать рельеф поверхности мембран.

3 Метод высоковольтной микроскопии

Ускоряющее напряжение такого микроскопа составляет 1-3 млн вольт. Такое напряжение позволяет рассматривать объекты большей толщины(1-10 мкм), а использую стереоскопическую съемку, мы можем получить информацию о 3D организации внутриклеточных структур с высоким разрешением.

4 Метод сканирующей (растровой) электронной микроскопии

При использовании этого метода объект покрывается тонким слоем испаренного металла, отражаясь от которого, зонд(пучок электронов) попадает в приемное устройство, откуда далее передается сигнал. При этом получается практически трехмерное изображение поверхности исследуемого объекта, благодаря очень большой глубине фокуса. Также можно получить информацию о химическом составе клеток.

3. Световой и электронный микроскопы

1 Строение светового микроскопа и его основные характеристики

Чтобы понять принцип работы светового микроскопа, необходимо рассмотреть его строение.

Главный прибор биологии является оптической системой, которая состоит из штатива, осветительной и оптической части. В штатив входят башмак; предметный столик с держателем предметного стекла и двумя винтами, перемещающими столик в двух перпендикулярных направлениях; тубус, тубусодержатель; макро- и микровинты, передвигающие тубус в вертикальном направлении.

Для освещения объекта используют естественное рассеянное или искусственное освещение, которое осуществляется посредством стационарно вмонтированного в башмак микроскопа или соединенного через планку осветителя.

В осветительную систему также входят зеркало с плоской и вогнутой поверхностями и конденсор, расположенный под предметным столиком и состоящий из 2 линз, ирисовой диафрагмы и откидывающейся оправы для светофильтров. Оптическая часть включает наборы объективов и окуляров, которые позволяют изучать клетки на разных увеличениях.

Принцип работа светового микроскопа заключается в том, что пучок света от источника освещения собирается в конденсаторе и направляется на объект. Пройдя через него, лучи света попадают в систему линз объектива. Они выстраивают первичное изображение, которое увеличивается при помощи линз окуляра. В целом объектив и окуляр дают обратное мнимое и увеличенное изображение объекта.

Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст.

Разрешающая способность - это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно.

,

где λ - длина волны света осветителя,

α - угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в него,- коэффициент преломления среды.

Чем меньше длина волны луча, тем более мелкие детали мы сможем наблюдать через микроскоп. И чем выше нумерическая апертура объектива (n, тем выше разрешение объектива.

Световой микроскоп может повысить разрешающую способность человеческого глаза примерно в 1000 раз. Это является "полезным" увеличением микроскопа. При использовании видимой части спектра света конченый предел разрешения светового микроскопа составляет 0,2-0,3 мкм.

Однако следует отметить, что световая микроскопия позволяет нам увидеть частицы, меньшие предела разрешения. Это можно осуществить благодаря методу "Темного поля" или "Ультрамикроскопии".

Рис. 1 Световой микроскоп: 1 - штатив; 2 - предметный столик; 3 - насадка; 4 - окуляр; 5 - тубус; 6 - устройство смены объективов; 7 - микрообъектив; 8 - конденсор; 9 - механизм перемещения конденсора; 10 - коллектор; 11 - осветительная система; 12 - механизм фокусировки микроскопа.

2 Строение электронного микроскопа

Основная часть электронного микроскопа - полый вакуумный цилиндр (воздух откачан, чтобы исключить взаимодействие электронов с его составляющими и оксисления нити катода). Между катодом и анодом подаётся высокое напряжение, для дополнительного ускорения электронов. В конденсорной линзе(которая представляет собой электромагнит, как и все линзы электронного микроскопа) пучок электронов фокусируется и попадает на изучаемый объект. Прошедшие электроны, формируют на объективной линзе увеличенное первичное изображение, которое увеличивает проекционная линза, и проецируется на экран, который покрыт люминесцентным слоем для свечения при попадании на него электронов.

Рис. 2. Электронный микроскоп: 1 - электронная пушка; 2 - анод; 3 - катушка для юстировки пушки; 4 - клапан пушки; 5 - 1-я конденсорная линза; 6 - 2-я конденсорная линза; 7 - катушка для наклона пучка;8 - конденсор 2 диафрагмы; 9 - объективная линза; 10 - блок образца; 11 -дифракционная диафрагма; 12 - дифракционная линза; 13 - промежуточная линза; 14 - 1-я проекционная линза; 15 - 2-я проекционная линза; 16 - бинокуляр (увеличение 12); 17 - вакуумный блок колонны; 18 - камера для 35-миллиметровой катушечной пленки; 19 - экран для фокусировки; 20 - камера для пластинок; 21 - главный экран; 22 - ионный сорбционный насос.

Библиография

Учебная литература

.Ю.С. Ченцов, Введение в клеточную биологию, издание 4

Интернет сайты

.#"justify">.#"justify">.#"justify">.#"justify">.#"justify">.#"justify">.http://immunologja.ru/267/

Световая микроскопия
Световой микроскоп, главный прибор биологии, представляет собой оптическую систему, состоящую из конденсатора, объектива. Пучок света от источника освещения собирается в конденсаторе и направляется на объект (рис. 1). Пройдя через объект, лучи света попадают в систему линз объектива; они строят первичное изображение, которое увеличивается с помощью линз окуляра. Главная оптическая часть микроскопа, определяющая его основные возможности, - объектив. В современных микроскопах объективы сменные, что позволяет изучать клетки при разных увеличениях. Главной характеристикой микроскопа как оптической системы является разрешающая способность. Изображения, даваемые объективом, можно увеличить во много раз, применяя сильный окуляр или, например, путем проекции на экран (до 105 раз). Вычислено, что разрешающая способность объектива, т.е. минимальное расстояние между двумя точками, которые видны раздельно, будет равно

где? - длина волны света, используемого для освещения объекта; n – коэффициент преломления среды; ? - угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив. Разрешение микроскопа зависит от длины волны – чем она меньше, тем меньшего размера деталь мы можем увидеть, и от нумерической апертуры объектива (n sin ?) – чем она выше, тем выше разрешение. Обычно в световых микроскопах используются источники освещения в видимой области спектра (400-700 нм), поэтому максимальное разрешение микроскопа в этом случае может быть не выше 200-350 нм (0,2-0,35 мкм). Если использовать ультрафиолетовый свет (260-280 нм), то можно повысить разрешение до 130-140 нм (0,13-0,14 мкм). Это будет пределом теоретического разрешения светового микроскопа, определяемого волновой природой света. Таким образом, все, что может дать световой микроскоп как вспомогательный прибор к нашему глазу, - это повысить разрешающую способность его примерно в 1000 раз (невооруженный глаз человека имеет разрешающую
способность около 0,1 мм, что равно 100 мкм). Это и есть «полезное» увеличение микроскопа, выше которого мы будем только увеличивать контуры изображения, не открывая в нем новых деталей. Следовательно, при использовании видимой области света 0,2-0,3 мкм является конечным пределом разрешения светового микроскопа.
Но все же в световом микроскопе можно видеть частицы меньшей величины, чем 0,2 мкм. Это метод «темного поля», или, как его называли раньше, метод «ультрамикроскопии». Суть его в том, что подобно пылинкам в луче света (эффект Тиндаля) в клетке при боковом освещении светятся мельчайшие частицы (меньше 0,2 мкм), отраженный свет от которых попадает в объектив микроскопа. Этот метод успешно применяется при изучении живых клеток.
Если же необработанные живые или мертвые клетки рассматривать в проходящем свете, то в них различаются только крупные детали из-за того, что они обладают иным коэффициентом преломления и поглощения световых лучей, чем окружающая среда. Большая
же часть клеточных компонентов мало отличается по этим свойствам как от среды (воды или тканевых растворов), так и друг от друга и поэтому мало заметны и не контрастны. Для их изучения приходится изменять освещенность (теряя при этом в четкости изображения) или применять особые методы и приборы. Один из таких приемов – метод фазово-контрастной микроскопии, широко использующийся для наблюдений за живыми клетками. Он основан на том, что отдельные участки прозрачной в общем клетки хоть мало, но все же отличаются друг от друга по плотности и по светопреломлению. Проходя через них, свет изменяет свою фазу, однако такое изменение фазы световой волны наш глаз не улавливает, так как он чувствителен только к изменению интенсивности света. Последняя зависит от величины амплитуды световой волны. В фазово-контрастном микроскопе в объектив вмонтирована специальная пластинка, проходя через которую луч света испытывает дополнительный сдвиг фазы колебаний. При построении изображения взаимодействуют уже лучи, находящиеся
в одной фазе либо в противофазе, но обладающие разной амплитудой; тем самым создается светло-темное контрастное изображение объекта.
Сходный прием используется в интерференционном микроскопе. Он устроен так, что пучок параллельных световых лучей от осветителя разделяется на два потока. Один из них проходит через объект и приобретает изменения в фазе колебания, другой идет, минуя объект. В призмах объектива оба потока вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности. В этом приборе, измеряя сдвиги фаз, можно определить концентрацию и массу сухого вещества в объекте.
С помощью поляризационного микроскопа изучают объекты, обладающие так называемой изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц (например, волокна веретена деления, миофибриллы и др.). У такого микроскопа перед конденсором
помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Поляризатор и анализатор – это призмы, сделанные из исландского шпата (призмы Николя). Если вторую призму (анализатор) повернуть затем на 90о по отношению к первой, то свет проходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий двойным лучепреломлением, т.е. способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.
Витальное (прижизненное) изучение клеток
Световой микроскоп позволяет видеть живые клетки. Для кратковременного наблюдения клетки помещают просто в жидкую среду на предметное стекло; если нужно длительное наблюдение за клетками, то
используются специальные камеры. Это или плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкими стеклами, или же разборные плоские камеры. В качестве объектов можно использовать свободноживущие клетки простейших и других одноклеточных организмов, клетки крови или же разобщенные тканевые клетки многоклеточных организмов как животного, так и растительного происхождения. В любом из этих случаев клетки изучают в специально подобранных средах. Свободноживущие одноклеточные организмы рассматривают и изучают в тех же средах, в которых они живут в естественных условиях или культивируются в лаборатории. Так, для некоторых простейших созданы искусственные среды, на которых они растут и размножаются. Обычно это сбалансированные солевые растворы с добавками микроорганизмов или других простейших, служащих пищей для данного вида организма.
Клетки крови или другие свободные клетки многоклеточных могут изучаться в капле плазмы или в специальных синтетических средах.
Для изучения клеток органов и тканей животных используют
метод клеточных культур. Более простой вариант этого метода заключается в том, что в камеру, наполненную питательной средой (смесь плазмы крови с эмбриональным экстрактом или смесь синтетической среды с добавлением плазмы крови), помещают небольшой кусочек живой ткани. Через некоторое время на периферии такого кусочка начинается деление и рост клеток. В другом случае вырезанный кусочек ткани слегка обрабатывают раствором фермента трипсина или хелатона - версена, что приводит к его диссоциации, к полному разобщению клеток друг от друга. Затем такую взвесь отмытых клеток помещают в сосуд с питательной средой, где они опускаются на дно, прикрепляются к стеклу и начинают размножаться, образуя сначала колонии, а затем сплошной клеточный пласт. Так растут однослойные клеточные культуры, очень удобные для прижизненных наблюдений. Лучше всего для получения первичных культур из тканей животных использовать эмбриональный материал; культуры из клеток взрослых организмов растут очень плохо.

При культивировании клеток вне организма кроме смены среды важно поддерживать и необходимую температуру (около 20о для хладнокровных и около 37о для теплокровных). Обязательным условием культивирования клеток является соблюдение стерильности. Существует целый ряд длительно культивируемых клеток; это специальные клеточные штаммы, приспособившиеся десятилетиями к росту вне организма. Большей частью это клетки опухолевого происхождения или значительно измененные клетки, приобретшие свойства опухолевых клеток.
Сейчас метод культивирования клеток вне организма широко используется не только для цитологических, но и для генетических, вирусологических и биохимических исследований.
В культуре можно выращивать и растительные клетки. Для этого кусочки ткани обрабатываются ферментами, растворяющими клеточные оболочки. Отделившиеся клеточные тела, протопласты, помещают в культуральную среду, где они делятся и образуют зоны размножившихся клеток.
Наблюдения за живыми клетками обычно регистрируются в виде
фотографий, сделанных с помощью специальных фотонасадок к микроскопу. Живые клетки можно снимать и на кинопленку. В ряде случаев такая микрокиносъемка дает очень важную информацию. Применяя ускоренную или замедленную киносъемку (цейтраферная киносъемка), можно подробно видеть протекание таких важных процессов, как деление клеток, фагоцитоз, течение цитоплазмы, биение ресничек и т.д.
Теперь с развитием компьютерных технологий с помощью специальных телекамер возможно получать изображение клеток прямо на мониторе компьютера, записывать их в памяти компьютера, всячески обрабатывать и получать отпечатки на принтерах цветных или черно-белых. Так же возможно использовать такую компьютерную видеотехнику для цейтраферной съемки подвижных объектов.
При исследовании живых клеток используют методы микрохирургии, оперативного воздействия на клетки. С помощью прибора микроманипулятора клетки разрезают, извлекают из них части, вводят вещества (микроинъекция) и т.д. Микроманипулятор совмещается с обычным
микроскопом, в который наблюдают за ходом операции. Микрохирургическими инструментами служат стеклянные крючки, иглы, капилляры, которые имеют микроскопические размеры и изготовляются на специальных приспособлениях – «микрокузницах». При микроманипуляциях клетки помещают в специальные камеры, в которые вводят также инструменты. Так, с помощью микроманипулятора удалось пересадить ядра от одного штамма амебы другому и доказать, что именно клеточное ядро определяет физиологические особенности клетки в целом. С помощью микроманипулятора удалось инъецировать в клетку амебы коллоидное золото, а затем исследовать распределение его частиц в цитоплазме и ядре.
С помощью таких микрохирургических инструментов можно поворачивать в клетках митотические веретена, оттаскивать отдельные хромосомы, вводить в живую клетку меченые антитела или разные белковые молекулы. Кроме механического воздействия на клетки в микрохирургии в последнее время широко применяют микропучки ультрафиолетового
света или лазерные микропучки. Это дает возможность практически моментально инактивировать отдельные участки живой клетки. Так, например, можно инактивировать одно из ядрышек и следить за судьбой второго, интактного. В этом случае показано, что второе ядрышко принимает на себя дополнительную нагрузку и «работает за двоих». С помощью микропучков удается поразить часть митотической хромосомы или участок веретена деления. Оказалось, что поражение центромеры хромосомы выводит последнюю из процесса расхождения хромосом к полюсам клетки во время митоза. Недавно стали применять аппараты с лазерным микролучом, что позволяет очень точно дозировать количество энергии в точке поражения и использовать очень короткие (наносекунды) импульсы облучения.
При изучении живых клеток пытаются их окрашивать с помощью так называемых витальных красителей. Это красители кислой (трипановый синий, литиевый кармин) природы, применяемые при очень большом разведении (1: 200000), следовательно,
влияние красителя на жизнедеятельность клетки минимальное. При окрашивании живых клеток краситель собирается в цитоплазме в виде гранул, а в поврежденных или мертвых клетках происходит диффузное окрашивание цитоплазмы и ядра.
При изучении живых клеток широко используют флуоресцирующие красители и метод флуоресцентной микроскопии. Суть его заключается в том, что целый ряд веществ обладает способностью светиться (флуоресцировать, люминесцировать) при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции всегда смещен в сторону больших длин волн по отношению к возбуждающему флуоресценцию излучению. Так, например, выделенный хлорофилл при освещении в ультрафиолетовых лучах светится красным цветом. Этот принцип используется в флуоресцентной микроскопии: рассматривание флуоресцирующих объектов в зоне коротких длин волн. Обычно в таких микроскопах применяются фильтры, дающие освещение в сине-фиолетовой области. Существуют ультрафиолетовые люминесцентные микроскопы.

Собственной флуоресценцией обладают некоторые пигменты (хлорофиллы, бактериальные пигменты), витамины (А и В2), гормоны. Если во флуоресцентный микроскоп рассматривать клетки растений, то на темно-синем фоне будут видны ярко светящиеся красные зерна внутри клетки – это хлоропласты.
Можно применять метод флуоресцентной микроскопии, добавляя живым клеткам флуорохромы (флуоресцирующие вещества). Этот способ сходен с витальным окрашиванием в том смысле, что здесь также используют очень низкие концентрации красителя (1 х 10-4–1 х 10-5). Многие флуорохромы избирательно связываются с определенными структурами клетки, вызывая их вторичную люминесценцию. Так, например, флуорохром акридиновый оранжевый избирательно связывается с нуклеиновыми кислотами. Причем, связываясь в мономерной форме с ДНК, он флуоресцирует зеленым цветом, а в димерной форме с РНК светится красным цветом. Наблюдая за живыми клетками, окрашенными акридиновым оранжевым, видно, что их ядра имеют зеленый цвет свечения, а цитоплазма
и ядрышки святятся красным цветом. Тем самым в живой клетке с помощью этого метода можно видеть локализацию (а в некоторых случаях рассчитывать количество) тех или иных химических веществ. Существуют флуорохромы, избирательно связывающиеся с липидами, слизью, кератином и др.
В живые клетки можно инъецировать также меченые флуорохромами антитела. Так, например, введенные в клетку связанные с флуорохромом антитела к белку тубулину соединяются с микротрубочками, которые теперь можно наблюдать в живых клетках с помощью флуоресцентного микроскопа.
В последнее время начинает широко использоваться для изучения живых клеток или их компонентов сочетание световой микроскопии (особенно фазовоконтрастной) с электроннно-компьютерной обработкой изображения. При этом используется видеозапись с электронной обработкой изображения, которая как бы «убирает» фоновые уровни и выделяет, контрастирует наблюдаемые структуры. Такая методика позволяет на телеэкране видеть такие структуры
как микротрубочки, размер которых (20 нм) намного меньше разрешающей силы светового микроскопа. Применение таких систем не только заменяют цейтраферную киносъемку, вместо которой используется видео-запись, но и позволяет компьютерную обработку изображения: сведения о плотности структур, о их параметрах, числе и трехмерной организации. В сочетании с флуоресцентной микроскопией эти методы открывают огромные перспективы в изучении живых клеток.
Обычные методы световой микроскопии трудно использовать для воспроизведения трехмерной картины изучаемого объекта из-за небольшой глубины резкости микроскопа. Обычно клетки рассматриваются как оптические разрезы на данной глубине фокуса. Для того, чтобы получить полную трехмерную реконструкцию объекта используют специальный конфокальный сканирующий световой микроскоп. С помощью этого прибора получают серии последовательных оптических срезов, взятых с различной глубины и изображения которых накапливаются в компьютере, и по специальной
программе реконструируется трехмерное, объемное, изображение объекта. Обычно используются объекты, окрашенные флуорохромами.
Изучение фиксированных клеток
Несмотря на важность и достаточную простоту витальных наблюдений, большая часть сведений о структуре и свойствах клеток получена на фиксированном материале. Если клетку повредить, она начинает претерпевать ряд изменений, а после смерти клетки в ней активируются автолитические ферменты, что приводит к грубым изменениям клеточной структуры. Следовательно, задачи фиксации – это убить клетку, прекратить активность внутриклеточных ферментов, предотвратить распад клеточных компонентов, а также избежать потери структур и веществ, препятствовать появлению структур, отсутствующих в живой клетке (артефактные структуры). К сожалению, еще не найден такой химический фиксатор, который бы удовлетворял всем этим требованиям.
Часто для фиксации используются альдегиды и их смеси с другими веществами. В качестве фиксаторов применяют также спирты,
вызывающие необратимую денатурацию белков, осаждение нуклеиновых кислот и полисахаридов. Осаждающим действием обладают такие сулемовые фиксаторы и фиксаторы с пикриновой кислотой. Фиксаторы, содержащие четырехокись осмия (OsO4), хорошо сохраняют липиды.
После фиксации объекты в дальнейшем можно подвергать дополнительной обработке. Одной из главных таких обработок является окрашивание клеток. Именно дополнительное окрашивание клеток позволило выявить в них массу деталей.
Стекла с фиксированными мазками одноклеточных организмов или с клетками культуры ткани можно непосредственно помещать в красители. Но для окрашивания клеток в составе органов необходимо получить их срезы. Изучают такие срезы и отдельных клеток.
Для этого после фиксации кусочки органов обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, спирт замещают ксилолом, а ксилол – парафином. Таким образом, фиксированная ткань, минуя высушивание на воздухе, оказывается заключенной в твердую массу парафина, которую можно нарезать.

Срезы толщиной до 5-10 мкм получают на специальном приборе – микротоме. Такие срезы приклеиваются на предметное стекло: парафин растворяется в ксилоле, ксилол удаляется спиртами, которые замещаются водой. Теперь срезы можно окрашивать водными растворами красителей. Для изготовления постоянных препаратов окрашенные срезы снова обезвоживаются и заливаются в канадский бальзам под покровным стеклом, эти препараты можно длительно хранить.
Для окраски фиксированных тканей и клеток применяют различные натуральные и главным образом синтетические красители. Натуральные красители (гематоксилин, кармин и др.) употребляют в сочетании с протравами (окислы различных металлов), с которыми они образуют комплексные соединения (лаки).
Синтетические красители подразделяют на кислые и основные. Основные краски представляют собой соли красящих оснований, содержащие в своем составе аминогруппы, которые и определяют их щелочность. Такие красители образуют солевые связи с
кислотными группами в структурах клетки. Следовательно, участки клеток, богатые кислотными группами, свяжутся с основными красителями, будут, как их называют, базофильными. Кислотные красители содержат в своем составе гидроксильные группы, или группы SO2OH. Структуры клеток с основными (щелочными) свойствами связываются с кислотными красителями и называются ацидо- или оксифильными. Существует множество смесей таких красителей, которые одновременно могут окрашивать различные участки клеток в разные цвета и тем самым повышать контрастность клеточных и внеклеточных компонентов. Таким образом, используя всевозможные красители, исследователи не только добиваются четкости морфологической картины клетки, но получают некоторые сведения о химизме той или иной структуры.
Ряд красочных приемов, направленных на выявление специфических химических веществ, получил название гистохимических и цитохимических. Методов цитохимического анализа очень много.
Существует целый ряд специфических красочных приемов, прямо
выявляющих те или иные вещества. Это собственно гистохимические (цитохимические) реакции. Основные требования, предъявляемые к такого рода реакциям, следующие: специфичность связывания красителя, неизменность локализации вещества.
Примером такого рода цитохимических реакций может быть широко применяемая реакция на ДНК, реакция Фёльгена (рис. 8). Суть ее в том, что после специфического кислотного гидролиза только на ДНК в результате отщепления пуринов на дезоксирибозе образуются альдегидные группы. Эти группы могут взаимодействовать со специфическим индикатором, реактивом Шиффа (обесцвеченное основание фуксина), давая красное окрашивание в местах локализации ДНК. Связывание красителя в этом случае строго количественное, что позволяет не только обнаружить и указать места, где есть ДНК, но и измерить ее количество. Используя этот же принцип выявления альдегидных групп, можно в клетках видеть расположение полисахаридов после гидролиза их периодной кислотой (так называемая PAS-реакция).

Также специфически можно определить локализацию белков реакциями на отдельные аминокислоты (тирозин, триптофан, аргинин и др.). Липиды и жиры обнаруживают в клетках специальными красителями (судан черный), хорошо растворяющимися и аккумулирующимися в жировых включениях.
Целая группа цитохимических реакций связана с обнаружением ферментов. Общий принцип этих реакций в том, что в микроскоп видны не сами белковые ферменты, а места их локализации, которые обнаруживаются по продуктам их специфической ферментативной активности.
Количество конечного продукта цитохимической реакции можно определить с помощью метода цитофотометрии. Основу его составляет определение количества химических веществ по поглощению ими света определенной длины волны. Было найдено, что интенсивность поглощения лучей пропорциональна концентрации вещества при одной и той же толщине объекта. Следовательно, оценивая степень поглощения света данным веществом, можно узнать его количество. Для такого рода исследований используют
приборы – микроскопы-цитофотометры; у них за объективом расположен чувствительный фотометр, регистрирующий интенсивность прошедшего через объект светового потока. Зная площадь или объем измеряемой структуры и значение поглощения, можно определить как концентрацию данного вещества, так и его абсолютное содержание. Широко используется метод цитофотометрии при определении количества ДНК на клетку после реакции Фёльгена. В данном случае фотометрируется не сама ДНК, а содержание красно окрашенного фуксина, количество которого прчямо пропорционально содержанию ДНК. Сравнивая полученные величины поглощения со стандартами, можно получить точные значения количества ДНК, выраженные в граммах. Этот метод позволяет измерять количество ДНК до 10-12 – 10-14 г, в то время как микрохимические методы имеют чувствительность не более 10-6 г. С помощью цитофотометрии содержание ДНК в клетках определяется намного точнее обычных биохимических методов.
Количественную оценку получают не только поглощающие свет
объекты и вещества, но и излучающие (светящиеся). Так, разработаны приемы количественной флурометрии, позволяющие по степени свечения определить содержание веществ, с которыми связываются флуорохромы.
Для выявления специфически белков применяют иммунохимические реакции с использованием флуоресцирующих антител. Этот метод иммунофлуоресценции обладает очень большой специфичностью и чувствительностью. Его можно использовать для выявления не только белков, но и отдельных последовательностей нуклеотидов в ДНК или для определения мест локализации РНК-ДНК гибридных молекул. Для этого сначала на белок (например, тубулин) получают специфические сыворотки, содержащие антитела. Очищенные антитела химически соединяют с флуорохромами. Такие препараты наливают на объекты и с помощью люминесцентного микроскопа по свечению флуорохрома находят места локализации искомых белков в клетке. Однако для того, чтобы меченные флуорохромами антитела проникли в клетку, необходимо плазматическую мембрану
сделать проницаемой. Обычно это достигается фиксацией клеток и частичной экстракцией липидов из мембран. Для изучения с помощью этого метода цитоскелетных белков прибегают к растворению клеточных мембран различными детергентами.
Для выяснения локализации мест синтеза биополимеров, для определения путей переноса веществ в клетке, для наблюдения за миграцией или свойствами отельных клеток широко используют метод радиоавтографии – регистрации веществ, меченных изотопами (рис. 9). Принцип этого метода очень прост, он повторяет метод Беккереля, открывшего радиоактивный распад. При радиоавтографическом исследовании клеткам в среду вводится предшественник одного из макромолекулярных соединений (например, аминокислота или нуклеотид), один из атомов которого замещен радиоактивным изотопом. Например, вместо 12С введен атом 14С, вместо водорода – тритий 3Н и др. В процессе синтеза в биополимер включится и меченая молекула предшественника. Регистрировать ее место
в клетке можно с помощью фотоэмульсии. Если клетки в пласте или на срезе покрыть фотоэмульсией, то через некоторое время в результате распада изотопа – частицы, разлетающиеся хаотично в разных направлениях, попадут в зону чувствительного фотослоя и активируют в нем зерна бромистого серебра. Чем больше будет время экспозиции, т.е. контакта такой меченой клетки с фотоэмульсией, тем больше зерен AgBr будет засвечено. После экспозиции надо проявить препарат, при этом происходит восстановление серебра только в засвеченных гранулах, при фиксации препарата незасвеченные гранулы AgBr растворяются. В результате из массы гранул, которые покрывали объект, останутся только те, которые были активированы?-излучением. Просматривая в микроскоп такие препараты, поверх которых нанесен слой фотоэмульсии, исследователь находит места локализации зерен серебра, которые располагаются напротив мест, где содержится меченое вещество (рис. 9).
Этот метод имеет ограничения: точность его будет зависеть
от величины зерна AgBr и от энергии частицы. Чем больше величина зерна, тем с меньшей точностью можно узнать место расположения изотопа. И чем выше энергия частицы и длиннее ее пробег, тем дальше от места распада будет происходить активация зерен AgBr . Поэтому для метода радиоавтографии используют особые мелкозернистые фотоэмульсии (0,2-0,3 мкм) и изотопы с малой энергией?-частиц, главным образом изотоп водорода, тритий (3Н). Тритием могут быть мечены любые предшественники биологических макромолекул: нуклеотиды, аминокислоты, сахара, жирные кислоты. Используются также для радиоавтографических исследованных меченые гормоны, антибиотики, ингибиторы и др. Радиоавтографически нельзя изучать растворимые в воде соединения, так как в процессе обработки клеток водными растворами (фиксация, проявление и т.д.) они могут потеряться. Другим ограничением метода является достаточно высокая концентрация данных веществ, так как при низкой концентрации радиоактивного вещества время экспозиции увеличивается, при этом растет
опасность появления фона засвеченных гранул AgBr за счет космического излучения.
Метод радиоавтографии – один из основных методов, позволяющих изучать динамику синтетических процессов, сравнить их интенсивность в разных клетках на одном и том же препарате. Так, например, с помощью этого метода при использовании меченых предшественников РНК было показано, что вся РНК синтезируется только в интерфазном ядре, а наличие цитоплазматической РНК является результатом миграции синтезированных молекул из ядра.
Метод радиоавтографии используется также для определения расположения определенных типов нуклеиновых кислот или отдельных нуклеотидных последовательностей в составе клеточных ядер или хромосом – метод молекулярной гибридизации. Для этого раствор с меченной нуклеиновой кислотой (например с рибосомной РНК) или с ее фрагментом (например, с сателитной ДНК) наносят на препарат, предварительно обработанный так, чтобы денатурировать ДНК (разорвать водородные связи в нативной ДНК) в составе
хромосом или ядер, что достигается щелочной или температурной обработкой образца,. В процессе ренатурации ДНК происходит образование молекулярного гибрида между меченой нуклеиновой кислотой из раствора и комплементарным ему участком ДНК в препарате. Место такой гибридизации определяется радиоавтографически. Этот метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот позволяет с большой точностью локализовать на хромосоме места с данной нуклеотидной последовательностью или даже расположение определенных генов.
Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот используется также при окраске их флуорохромами. Например, если выделенную ядрышковую ДНК, ответственную за синтез рибосомных РНК, предварительно связать с каким-либо флуорохромом, то после проведения ренатурации ДНК на препаратах с этой флуоресциирующей рибосомной ДНК, можно видеть, что флуоресценция будет наблюдаться только в ядрышках интерфазных клеток или только в зонах ядрышковых организаторов митотических хромосом. Таким образом
можно в клетках локализовать любые последовательности ДНК и даже расположение в ядрах отдельных хромосом. Этот прием называется FISH-метод (флуоресцентная in situ гибридизация).
Электронная микроскопия
Рассматривая характеристики светового микроскопа, можно убедиться, что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения, испускающего волны с наименьшей длиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает поток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания электронного микроскопа, в котором уже сейчас достигнуто разрешение в 1 А (0,1 нм). По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо
сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку (рис. 7).
Основная часть такого микроскопа представляет собой полый цилиндр (колонка микроскопа), из которого откачан воздух для того, чтобы не было взаимодействия электронов с молекулами газов и окисления вольфрамовой нити накаливания в катоде электронной пушки. Между катодом и анодом подается высокое напряжение (от 50 до 200-5000 кВ), что служит причиной ускорения электронов. В центре анода есть отверстие, проходя через которое электроны формируют пучок, идущий вниз по колонке микроскопа. Линзы электронного микроскопа представляют собой электромагниты, поле которых может изменять путь электронов (как стеклянные линзы изменяют путь фотонов). В конденсорной линзе пучок электронов фиксируется и попадает на объект, с которым электроны взаимодействуют, отклоняются, рассеиваются, поглощаются или проходят без изменения. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются объективной линзой, которая формирует
увеличенное первичное изображение объекта. Так же как в световом микроскопе, объективная линза определяет его основные показатели. Первичное изображение увеличивается проекционной линзой и проецируется на экран, покрытый люминесцентным слоем, светящимся при попадании на него электронов. Вместо светящегося экрана изображение можно поместить на фотопластинку и получить снимок.
Напряжение, которое используется для ускорения электронов в большинстве просвечивающих (трансмиссионных) электронных микроскопов, достигает 50-150 кВ. При напряжении в 50 кВ электрон обладает длиной волны в 0,05 А, и в этом случае теоретически можно было бы получить разрешение в 0,025 А (d ~ 0,5 ?). Однако в современных конструкциях электронных микроскопов достигается разрешение около 1 А из-за недостаточной стабильности напряжения, стабильности тока линз, неоднородности металла магнитных линз и других несовершенств прибора (теоретически возможно еще повысить разрешение электронного микроскопа
в 100 раз). Но и достигнутое разрешение огромно (вспомним, что величина О-Н связи в молекуле воды равна 0,99 А): оно сейчас уже в 106 раз выше разрешающей способности глаза!
На экранах и фотопластинках электронных микроскопов можно получить увеличение до 50 000 раз, в дальнейшем при фотопечати можно получить еще 10-кратное увеличение, так что конечное увеличение, при котором максимально реализуется разрешение, может достигать 106 раз (например, если 1 мм увеличить в 106 раз, то он достигнет длины в 1 км).
В настоящее время электронно-микроскопическое изображение с флуоресцирующего экрана с помощью цифровой телекамеры передается прямо в компьютер, где на экране монитора его можно обрабатывать различным образом (изменять увеличение, контрастность изображения, применять денситометрию, плани- и морфометрию отдельных компонентов). Используя принтер можно получить отпечатки полученных изображений.
Максимальное разрешение электронного микроскопа (ЭМ) реализуется
сейчас только при исследовании металлов или кристаллических решеток. На биологических объектах такого разрешения получить пока не удается из-за низкой контрастности объекта. Биологические объекты для исследования в ЭМ помещаются на медные сеточки, покрытые тонкими пленками – подложками (формвар, коллодий, углерод), состоящими в основном из углерода. Биологические объекты также в основном содержат углерод и, следовательно, мало по плотности будут отличаться от фона, будут мало контрастны. Показано, что минимальная толщина биологического объекта с плотностью около 1 г/см3, выявляемого при ускоряющем напряжении в электронном микроскопе 50 кВ, равна 50 А. Вирусы, расположенные на поддерживающей пленке, будут видны в этом случае в виде бесструктурных пятен, а молекулы нуклеиновых кислот (толщина ДНК равна 20 А) вообще не видны из-за низкого контраста. Контраст биологических объектов можно повысить, используя тяжелые металлы или их соли.
Контрастирование корпускулярных объектов

Корпускулярными объектами можно назвать частички вирусов, фагов, выделенные клеточные компоненты (рибосомы, мембраны, вакуоли и т.д.), макромолекулы.
Одним из широко распространенных методов контрастирования биологических объектов является оттенение металлами. В этом случае в специальных вакуумных установках производится термическое испарение металла. При этом атомы металла разлетаются от места испарения по прямым траекториям. Встречаясь с объектом, они осаждаются на нем в виде слоя; его толщина будет больше в местах, перпендикулярных направлению полета частиц металла. В участках, где объект экранирует пучок частиц, возникнут «тени». Таким образом, напыленная часть объекта обладает большей плотностью, чем напыленная подложка (фон), и поэтому объект будет виден. Этот метод широко применяется не только для контрастирования вирусов, рибосом, но и для достаточно тонких молекул нуклеиновых кислот. Минус этого метода в том, что он приводит к увеличению размеров объекта на толщину
напыленного слоя, который в лучшем случае достигает 10-15 А. Другой недостаток его в том, что он дает информацию только о внешнем виде и объеме частиц. Для контрастирования оттенением используется платина, палладий, их сплавы, уран.
При негативном контрастировании объектов растворами солей тяжелых металлов применяют молибденовокислый аммоний, уранилацетат, фосфорно-вольфрамовую кислоту (ФВК) (рис. 10). Если водные растворы таких веществ смешать с биологическими объектами, а затем их нанести на пленки-подложки и высушить, то объекты (например, вирусы или белковые комплексы) окажутся как бы погруженными в тонкий слой аморфного вещества высокой плотности. В электронном микроскопе они выглядят как светлые объекты на темном фоне (как фотонегатив). Преимущества метода в том, что растворенные соли могут проникать в глубь объекта и выявлять дополнительные его детали. Негативное контрастирование широко применяется при изучении вирусов, ферментных комплексов мембран. Нитчатые молекулы нуклеиновых кислот этим методом
выявляются плохо из-за их малой толщины.
Соли тяжелых металлов можно использовать при так называемом позитивном контрастировании. В этом случае контрастирующее вещество связывается со структурой, повышает ее электронную плотность. Часто для позитивного контрастирования нуклеиновых кислот используют растворы уранилацетата в спирте или в ацетоне. Уранилацетат, контрастируя нуклеиновые кислоты, хорошо прокрашивает центральные полости сферических вирусов, значительно повышает контраст рибосом и позволяет видеть тонкие нити выделенных нуклеиновых кислот.
Ультрамикротомия
При изучении объектов в электронном микроскопе возникает еще одно осложнение – это их толщина. Дело в том, что при прохождении пучка электронов через объект часть электронов поглощается, что приводит к нагреванию объекта и к его деформации. Поэтому необходимо иметь тонкие объекты (не выше 0,1 мкм). Другое ограничение заключается в том, что даже если мы будем рассматривать неизменяющиеся объекты большой толщины (около
0,5-1 мкм), что в принципе возможно (например, в мегавольтном электронном микроскопе, см. ниже), то на конечном изображении будут наслаиваться проекции структур, располагающихся на разных уровнях по толщине объекта. Тем самым изучать в трансмиссионных микроскопах внутреннее строение целых клеток плохо и неудобно. Выход из этого положения аналогичен тому, что было найдено для световой микроскопии, - делать срезы очень малой толщины, ультратонкие срезы (0,05-0,10 мкм).
Процедура их изготовления в принципе сходна стой, что используется в световой микроскопии. Клетки и ткани для этого сначала фиксируют. В качестве фиксаторов используются буферные растворы глутарового альдегида или четырехокиси осмия. Наиболее часто применяется двойная фиксация: сначала глутаровый альдегид, а затем осмий, который как тяжелый металл контрастирует клеточные структуры. Затем, после обезвоживания, ткани пропитываются эпоксидными смолами или другими пластиками в жидкой, мономерной
форме. При полимеризации таких пластмасс пропитанный ими объект оказывается заключенным в твердые блоки, которые уже можно резать на тонкие срезы. Здесь возникают две проблемы: где взять идеальные ножи, изъяны которых не сказывались бы при изучении клеток на почти молекулярных уровнях, и как изготовить срезы толщиной в сотые доли микрона. Первая задача была решена таким образом: оказалось, что идеально острой и без зазубрин режущей поверхностью обладают сколы стекла (рис. 11). Но стеклянные ножи очень недолговечны, их используют только один раз. Применяют алмазные ножи: это специальным образом заточенные мелкие алмазы, они служат в течение нескольких лет.
Проблема изготовления сверхтонкого среза была решена тоже, казалось бы, просто – это термическая подача объекта. Блок с заключенным в пластмассу объектом крепится на металлическом стержне, который нагревается и тем самым продвигает объект вперед на определенную величину за известное время. И если эту термическую подачу согласовать с ритмическими циклами
резания, то можно получить серии срезов заданной толщины. Это достигается при использовании специальных приборов – ультрамикротомов. Существуют конструкции ультрамикротомов, где подача объекта осуществляется механически.
Площадь получаемых ультратонких срезов обычно очень мала (0,1-1 мм2), поэтому все операции при ультрамикротомировании идут под микроскопическим контролем. Срезы, смонтированные на сетках с подложкой, необходимо дополнительно контрастировать – «окрашивать» с помощью солей тяжелых металлов. В этом случае используют также соли свинца и урана, которые связываясь с внутриклеточными структурами на срезе, позитивно их контрастируют.
Техника изготовления ультратонких срезов открыла огромные возможности для применения электронной микроскопии буквально во всех областях биологии и медицины
Этот метод позволяет применять цитохимические приемы на уровне электронной микроскопии: в данном случае необходимо, чтобы продукты реакции были электронноплотными, отклоняли
бы электроны. Кроме того, реакции не должны приводить к появлению артефактных картин уже на ультраструктурном уровне. Число цитохимических методов в электронной микроскопии пока не велико, но это направление интенсивно разрабатывается.
В электронно-микроскопических исследованиях оказалось возможным применить методы радиоавтографии. В этом случае используются сверхтонкозернистые эмульсии (величина гранул около 0,02-0,06 мкм). Недостатком этого метода является очень большое время экспозиции, в некоторых случаях достигающие нескольких месяцев.
Все большее применение получают методы приготовления ультратонких срезов без фиксации и заливки клеток в твердые пластмассы. Это методы криоультрамикротомии, т.е. получение срезов с замороженных тканей, моментально охлажденных до температуры жидкого азота (-196оС). При этом происходит практически одномоментное торможение всех метаболических процессов, а вода из жидкой фазы переходит в твердую, но не кристаллическую,
ее молекулярная структура беспорядочна (стекловидное состояние). Такие твердые блоки при температуре жидкого азота можно резать на ультратонкие срезы (нож при этом также охлажден). Полученные срезы используют для выявления в них активности ферментов, для проведения на них иммунохимических реакций, для ферментативного переваривания и т.п.
Для проведения иммунохимических исследований используют антитела, связанные с частицами коллоидного золота, локализация которого на препаратах и указывает на места расположения искомого антигена.
Изучение срезов, полученных на криоультратомах, показало, что общая структура и композиция клеточных компонентов в данном случае мало отличаются от того, что видно при использовании химической фиксации и обычных приемов получения ультратонких срезов. Следовательно, те структуры, которые имеют одинаковую композицию при разных методах обработки материала, по-видимому, близки к своему прижизненному строению, не являются артефактными.

В пользу этого говорят данные по исследованию клеток с помощью иных приемов электронной микроскопии.
Для изучения структуры различных мембранных компонентов клетки используется метод замораживания–скалывания. Он заключается в том, что объект сначала быстро замораживают жидким азотом, а затем при той же температуре переносят в специальную вакуумную установку. Там замороженный объект механическим способом скалывается охлажденным ножом. При этом обнажаются внутренние зоны замороженных клеток В вакууме часть воды, перешедшей в стекловидную форму, возгоняется («травление»), а поверхность скола последовательно покрывается тонким слоем испаренного углерода, а затем металла. Таким образом с замороженного и сохраняющего прижизненную структуру материала получают реплику с его скола (рис. 12). Затем уже в условиях комнатной температуры ткань или клетки растворяют в кислотах, но пленка-реплика при этом остается цела, ее изучают в электронном микроскопе. Этот метод имеет два преимущества: изучают реплики со сколов
нативных образцов; исследуют рельеф поверхности мембран клетки, что недостижимо другими методами. Оказалось, что и в этом случае общая организация клетки и ее компонентов сходна с тем, что мы видим при химической фиксации или при криотомии. Этот метод позволил увидеть, что как на поверхности, так и в толщине клеточных мембран располагаются глобулы интегральных белков, что мембраны не однородны по своей структуре.
Метод получения реплик с микрорельефа образца широко применяется при изучении фибриллярных компонентов клетки. Так при изучении цитоскелета клеток культуры ткани или форменных элементов крови клетки обрабатывают детергентами для того, чтобы растворить все мембраны. Это приводит к тому, что из клетки вымываются все компоненты, кроме фибриллярных белковых компонентов цитоскелета и материалы ядра. Такие препараты затем фиксируются, обезвоживаются и специальным образом сушатся. Вслед за этим сухие препараты напыляются углеродом и контрастируются распылением
тяжелых металлов, после чего такая реплика снимается со стекла, на котором росли клетки, и просматривается в трансмиссионном электронном микроскопе.
Другие специальные методы электронной микроскопии биологических объектов
В последнее время начинают применять методы высоковольтной (вернее, сверхвысоковольтной) микроскопии. Сконструированы приборы с ускоряющим напряжением 1-3 млн. вольт. Это очень дорогие приборы, что сдерживает их широкое применение. Преимущество этого класса электронных микроскопов не в том, что на них можно получить более высокое разрешение (при более короткой длине волны электронов), а в том, что при высокой энергии электронов, которые меньше поглощаются объектом, можно просматривать образцы большой толщины (1-10 мкм). Дополнительное использование стереоскопической съемки позволяет получить информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высоким их разрешением (около 0,5 нм).
Метод сканирующей (растровой) электронной микроскопии позволяет
изучать трехмерную картину поверхности клетки. При сканирующей электронной микроскопии тонкий пучок электронов (зонд) пробегает по поверхности объекта и полученная информация передается на электронно-лучевую трубку. Изображение может быть получено в отраженных или вторичных электронах. При этом методе фиксированный и специальным образом высушенный объект покрывается тонким слоем испаренного металла (чаще всего золота), отражаясь от которого электроны попадают в приемное устройство, передающее сигнал на электронно-лучевую трубку. Благодаря огромной глубине фокуса сканирующего микроскопа, которая значительно больше, чем у просвечивающего, получается почти трехмерное изображение исследуемой поверхности. Разрешающая способность этого типа приборов несколько ниже, чем у просвечивающих электронных микроскопов, но уже сейчас выпускаются приборы с разрешением 3-5 нм (рис. 13).
С помощью растровой электронной микроскопии можно получить информацию о химическом составе в тех или иных участках
клеток. Так, метод рентгеноспектрального микроанализа основан на идентификации и количественной оценке содержания химических элементов по спектрам характеристического рентгеновского излучения, возникающего при взаимодействии первичных электронов с атомами объекта. Для получения такой информации, конечно, объекты не следует покрывать слоем металла, как при обычном методе сканирующей электронной микроскопии. Более того, объект нужно подготовить так, чтобы не было потери или дополнительного внесения элементов. Для этого используют быстро замороженные и высушенные в вакууме объекты.
Фракционирование клеток
В цитологии широко применяют различные методы биохимии, как аналитические, так и препаративные. В последнем случае можно получить в виде отдельных фракций разнообразные компоненты и изучать их химический состав, ультраструктуру и свойства. Так, в настоящее время в виде чистых фракций получают практически любые клеточные органеллы и структуры: ядра, ядрышки, хроматин,
ядерные оболочки, плазматическую мембрану, вакуоли эндоплазматического ретикулума, его рибосомы, рибосомы гиалоплазмы, аппарат Гольджи, митохондрии, их мембраны, пластиды, пероксисомы, микротрубочки и т.д., и т.п. В последнее время получены чистые фракции центриолей и ядерных пор.
Получение клеточных фракций начинается с общего разрушения клетки, с ее гомогенизации. Затем из гомогенатов уже можно выделять фракции. Одним из основных способов выделения клеточных структур является дифференциальное (разделительное) центрифугирование. Принцип его применения в том, что время для осаждения частиц в гомогенате зависит от их размера и плотности: чем больше частица или чем она тяжелее, тем быстрее она осядет на дно пробирки. Чтобы ускорить этот процесс оседания, используют ускорения, создаваемые центрифугой. При центрифугировании раньше всего и при небольших (1-3 тыс. g)ускорениях осядут ядра и неразрушенные клетки, при 15-30 тыс. g осядут крупные частицы, макросомы, состоящие из митохондрий, мелких пластид,
пероксисом, лизосом и др., при 50 тыс. g осядут микросомы, фрагменты вакуолярной системы клетки. При повторном дробном центрифугировании этих смешанных подфракций можно получить чистые фракции. Так, при разделении макросомной подфракции получают отдельно митохондрии, лизосомы, пероксисомы. При разделении микросом можно получить фракцию мембран аппарата Гольджи, фрагментов плазматической мембраны, вакуолей, гранулярного ретикулума. В случаях более тонкого разделения фракций используют центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, что позволяет хорошо разделить компоненты, даже незначительно отличающиеся друг от друга по удельной массе.
Полученные фракции, прежде чем их анализировать биохимическими способами, необходимо проверить на чистоту с помощью электронного микроскопа.
Получение отдельных клеточных компонентов дает возможность изучать их биохимию и функциональные особенности. Так можно создать бесклеточную систему для рибосом, которые будут
синтезировать белок по заданной экспериментатором информационной РНК, выделенные митохондрии в подобранных условиях могут осуществлять синтез АТФ, на выделенном хроматине при участии соответствующих ферментов может происходить синтез РНК и т.д.
В последнее время применяются бесклеточные системы для воссоздания клеточных надмолекулярных структур. Так, используя очищенные от гранул желтки, экстракты цитоплазмы яиц земноводных или яиц морских ежей, можно получить ядра с ядерной оболочкой из введенной в эту бесклеточную систему чужеродной ДНК (например ДНК бактериофага). Такая ДНК связывается с белками-гистонами, которые есть в избытке в таком экстракте, образуется хроматин (дезоксирибонуклеопротеид), который покрывается двойной мембранной оболочкой, несущей даже ядерные поры. Такие модельные системы помогают изучать тонкие, интимные процессы, например транспорт макромолекул из цитоплазмы в ядро и наоборот. В цитоплазматических экстрактах яиц земноводных и иглокожих
такие ядра могут периодически делиться путем митоза. Эти модели внесли огромный вклад в расшифровку природы регуляции клеточного цикла.
Большой вклад в биологию клетки вносят методы клеточной инженерии. Было найдено, что различные живые клетки могут сливаться друг с другом, если специальными способами обработать их плазматические мембраны. Так можно слить эритроцит курицы и лимфоцит человека. При этом получается двуядерная клетка, гетерокарион, в котором происходит активация ядра куриного эритроцита (рис.14). Если гетерокарион образуется из близкородственных клеток (например, мыши и хомячки), то при вступлении их в митоз хромосомы могут объединиться в одну метафазную пластинку. После разделения такой клетки получится истинно гибридная клетка. Другие приемы позволяют конструировать клетки из разных по происхождению ядер и цитоплазмы (рис. 15). Так, разрушив актиновый компонент цитоскелета и подвергнув клетки центрифугированию можно клетку разделить на две части: ядро
с узким ободком цитоплазмы – кариопласт и на оставшуюся часть цитоплазмы – цитопласт. Затем используя разные кариопласты и цитопласты, можно создавать разные комбинации реконструированных клеток.
Методы клеточной инженерии широко применяются не только в экспериментальной биологии, но и в биотехнологических целях. Например, при получении моноклональных антител используются клеточные гибриды между лимфоцитами иммунизированных животных и интенсивно размножающимися клетками миеломы. Полученные первичные дикарионы образуют истинные гибридные клетки, которые интенсивно размножаются за счет генома опухолевых миеломных клеток, и одновременно выделяют большое количество антител, за счет работы генома иммунизированных лимфоцитов. Этот прием позволяет получать большое число гибридомных клеток, вырабатывающих большие количества необходимых антител.
Нет необходимости приводить описание всех методов и приемов, используемых в цитологии для изучения строения, химии и
функций клеток или их компонентов. Этого краткого обзора достаточно для того, чтобы показать богатство арсенала методов в цитологии, позволяющих давать точный анализ, начиная от формы, общего вида и размера клетки, кончая молекулярной композицией ее отдельных частей.

Свойства объёмного стекла увеличивать изображение были знакомы людям очень давно. Самая древняя линза, найденная археологами в Ираке близ города Нимруд, датируется VIII веком до нашей эры. Изобретатели этого полезного приспособления так и остались неизвестными. Неясно также, кто впервые применил его для создания микроскопа. Есть достоверные сведения, что комбинации из двух линз для своих приборов использовали знаменитые учёные XVI-XVII веков - Галилео Галилей, Джироламо Фракасторо, Кристиан Гюйгенс. История умалчивает, были эти приспособления изобретены до них, или нет. Но именно в ту эпоху оптика стала впервые применяться для изучения микромира.

Исследователи быстро поняли, что при использовании сразу нескольких линз их кратности увеличения предметов не складываются, а перемножаются друг на друга. И это даёт значительный эффект, позволяющий рассмотреть объекты микромира. Проблема состояла в том, что первые линзы были несовершенны и достаточно грубо обработаны. Поэтому изображение получалось с дефектами, которые увеличивались вместе с объектом исследований. Для решения этой проблемы разрабатывались микроскопы с единственной мощной линзой, один из которых позволил Антони Ван Левенгуку разглядеть растительную клетку. Лишь через полтора столетия многосоставные микроскопы, обладающие несколькими линзами, завоевали широкую популярность среди учёных. А с появлением электричества стала использоваться подсветка, значительно облегчившая процесс наблюдения. Именно так появился прибор, схожий по принципу работы с современным световым микроскопом.

Принцип работы

Световой микроскоп использует одно из неотъемлемых свойств луча света - преломление. Лучи подсветки отражаются в зеркальце, расходятся от объекта и параллельным пучком идут внутри тубуса, в котором размещены линзы. При помощи линз лучи преломляются, т.е. изменяют угол своего падения таким образом, что происходит их концентрация на сетчатке глаза. Таким способом объект наблюдения увеличивается и проступают его незаметные прежде детали.

Кратности увеличения

Окуляром микроскопа называется линза, в которую непосредственно смотрит глаз наблюдателя. Обычно для этих целей используются линзы с десятикратным увеличением. Ниже, в тубусе, располагается ряд объективов, каждый из которых имеет своё увеличение - 4, 10, 40 или же 100. Поскольку кратности перемножаются, то, в зависимости от выбранного объектива в сочетании с десятикратным окуляром, можно достигать кратности от 40 до 1000 соответственно.

Обычно наблюдение начинают с выбора четырёхкратного объектива, дающего наименьшее увеличение в 40 раз. Зачем? Дело в том, что для подробного рассмотрения какого-либо объекта нужно сперва этот объект найти. Осуществлять такой поиск при слишком большом увеличении неудобно. Поэтому при изучении микроскопического предмета, как правило, начинают от самого малого увеличения к большему. Объектив с маленьким увеличением позволяет гораздо быстрее фокусироваться, чем с большим.

Полезное и бесполезное увеличение

Увеличение бывает как полезным,так и бесполезным. В чём разница между тем и другим? Дело в том, что возможности любого светового микроскопа имеют предел. Теоретически возможно, используя множество линз, увеличить кратность прибора до бесконечности.

Но на практике наступает предел, после которого дальнейшее увеличение не делает видимыми новые детали объекта. До этого предела увеличение считается полезным, а после - бесполезным.

Разрешающая способность

Увеличивать изображение до бесконечности нет смысла потому, что разрешающая способность прибора конечна. Этой способностью называется расстояние между двумя близкими линиями, позволяющее видеть их раздельно. Для светового микроскопа такое расстояние достигает максимум 0,2 мкм. Именно этот фактор, а вовсе не конечные значения кратности, ограничивают область применения световой микроскопии. Более мелкие объекты доступны электронным и другим более современным микроскопам.

бъектив представляет собой цилиндр из металла (тубус), в который вмонтированы несколько линз. Его увеличение обозначают цифры.

Две или три линзы используются для окуляра. Предназначение расположенной между ними диафрагмой - фокусировка поля зрения. Нижней линзой фокусируются исходящие от объекта лучи, а само наблюдение происходит с помощью верхней.

В осветительном устройстве используются зеркало или электрический осветитель. Важной деталью является наличие конденсора, в состав которого входят две или три линзы. Подымаясь или опускаясь на кронштейне со специальным винтом, он может концентрировать или рассеивать свет, падающий на объект. Диаметр потока света изменяется специальной диафрагмой управляемый рычажком. Степень освещённости объекта регулирует кольцо, имеющее матовое стекло или светофильтр.

Составляющие механической системы микроскопа:

• Подставка.
• Коробка с микрометренными приспособлениями.
• Тубус.
• Тубусодержатель.
• Винт грубой наводки.
• Кроншетейн и винт перемещения конденсора.
• Револьвер.
• Предметный столик.

На предметном столике располагается объект наблюдения. Микрометренные механизмы предназначены для небольших перемещений тубусодержателя с тубусом, чтобы расстояние между объективом и объектом было оптимальным для наблюдения. Для более значительного смещения используют винты, осуществляющие грубую наводку. Функция револьвера - быстрая смена объективов. Это чрезвычайно удобное приспособление, которого не имели первые микроскопы, поэтому испытатели прошлого вынуждены были тратить на данную процедуру чрезвычайно много времени и усилий. Кронштейн, на котором держится конденсор, также способен подниматься и опускаться при помощи винта.

Обычно в световой микроскоп рассматривают микроскопические биологические объекты. Именно с его помощью была открыта живая клетка. Сегодня с помощью светового микроскопа можно исследовать целый ряд клеточных органелл, играющих важную роль в функционировании живого организма.

Именно такой микроскоп используется при преподавании школьного курса биологии.

В частности, при помощи этого прибора можно увидеть:

• Ядро , являющееся основным её компонентом.
• Стенку, образующую поверхностный клеточный аппарат, включая мембрану.
• Хлоропласты, содержащие важный для растительной клетки хлорофилл, с помощью которого углеводородов из воды и углекислого газа.
• Митохондриальные структуры и коплекс Гольджи, важные для клеточного метаболизма.

различные виды ресничек, жгутиков, вакуолей и светочувствительных органелл.

Новейшие достижения — самые мощные микроскопы

В 2006 году исследовательской группой во главе с немецким учёным Штефаном Хелем и аргентинцем Мариано Босси была завершена разработка оптического (светового) микроскопа, ставшего настоящим прорывом в технологиях исследований с помощью высокоточной оптики. Изобретение, которое назвали наноскопом, позволяет вести наблюдение за объектами размерами менее 10 нм. При этом получаются их высококачественные изображения в трёхмерном формате. Вероятно,это не предел - исследования в разных странах, направленных на повышение разрешающей способности светового микроскопа, продолжаются.

Для изучения клеток разработано и применяется множество методов, возможности которых определяют уровень наших знаний в этой области. Успехи в изучении биологии клетки, включая наиболее выдающиеся достижения последних лет, как правило, связаны с применением новых методов. Поэтому для более полного понимания клеточной биологии необходимо иметь хотя бы некоторое представление о соответствующих методах исследования клетки.

Световая микроскопия

Самым древним и, вместе с тем, наиболее распространенным методом изучения клетки является микроскопия. Можно сказать, что и начало изучения клетки было положено изобретением светового оптического микроскопа.

Невооруженный человеческий глаз имеет разрешающую способность около 1/10 мм. Это означает, что если вы смотрите на две линии, которые находятся друг от друга на расстоянии меньше 0,1 мм, они сливаются в одну. Чтобы различить структуры, расположенные более тесно, применяют оптические приборы, например, микроскоп.

Но возможности светового микроскопа не безграничны. Предел разрешения светового микроскопа задается длиной световой волны, то есть оптический микроскоп может быть использован только для изучения таких структур, минимальные размеры которых сопоставимы с длиной волны светового излучения. Лучший световой микроскоп имеет разрешающую способность около 0.2 мкм (или 200 нм), то есть примерно в 500 раз улучшает человеческий глаз. Теоретически построить световой микроскоп с большим разрешением невозможно.

Многие компоненты клетки близки по своей оптической плотности и без специальной обработки практически не видны в обычный световой микроскоп. Для того, чтобы сделать их видимыми, используют различные красители, обладающие определенной избирательностью.

В начале XIX в. Возникла потребность в красителях для окрашивания текстильных тканей, что в свою очередь вызвало ускоренное развитие органической химии. Оказалось, что некоторые из этих красителей окрашивают и биологические ткани и, что было уж совсем неожиданно, часто предпочтительно связываются с определенными компонентами клетки. Использование таких избирательных красителей дает возможность более тонко исследовать внутреннее строение клетки. Приведем лишь несколько примеров:

· краситель гематоксилин окрашивает некоторые компоненты ядра в синий или фиолетовый цвет;

· после обработки последовательно флороглюцином и затем соляной кислотой одревесневшие оболочки клеток становятся вишнево - красными;

· краситель судан III окращивает опробковевшие клеточные оболочки в розовый цвет;

· слабый раствор йода в йодистом калии окрашивает крахмальные зерна в синий цвет.

Для проведения микроскопических исследований большую часть тканей перед окраской фиксируют. После фиксации клетки становятся проницаемыми для красителей, а структура клетки стабилизируется. Одним из наиболее распространенных фиксаторов в ботанике является этиловый спирт.

Фиксация и окрашивание не единственные процедуры, используемые для приготовления препаратов. Толщина большинства тканей слишком велика, чтобы их сразу можно было наблюдать при высоком разрешении. Поэтому выполняют тонкие срезы на микротоме. В этом приборе использован принцип хлеборезки. Для растительных тканей изготавливают чуть более толстые срезы, чем для животных, поскольку клетки растений обычно крупнее. Толщина срезов растительных тканей для световой микроскопии около 10 мкм - 20 мкм. Некоторые ткани слишком мягкие, чтобы из них сразу же можно было получить срезы. Поэтому после фиксации их заливают в расплавленный парафин или специальную смолу, которые пропитывают всю ткань. После охлаждения образуется твердый блок, который затем режется на микротоме. Правда, для растительных тканей заливка применяется значительно реже, чем для животных. Это объясняется тем, что растительные клетки имеют прочные клеточные стенки, составляющие каркас ткани. Особенно прочны одревесневшие оболочки.

Однако заливка может нарушить структуру клетки, поэтому применяют еще и другой метод, где эта опасность уменьшена? быстрое замораживание. Здесь можно обойтись без фиксации и заливки. Замороженную ткань режут на специальном микротоме (криотоме).

Замороженные срезы, приготовленные таким способом, имеют явное преимущество, поскольку в них лучше сохраняются особенности естественной структуры. Однако их труднее готовить, а присутствие кристаллов льда все же нарушает некоторые детали.

Микроскопистов всегда беспокоила возможность потери и искажения некоторых компонентов клетки в процессе фиксации и окраски. Поэтому полученные результаты проверяют другими методами.

Весьма заманчивой представлялась возможность исследовать под микроскопом живые клетки, но так, чтобы более отчетливо проявились детали их строения. Такую возможность дают особые оптические системы: фазово-контрастный и интерференционный микроскопы. Хорошо известно, что световые волны, подобно волнам воды, могут интерферировать друг с другом, увеличивая или уменьшая амплитуду результирующих волн. В обычном микроскопе, проходя через отдельные компоненты клетки, световые волны меняют свою фазу, хотя человеческий глаз этих различий не улавливает. Но за счет интерференции можно преобразовать волны, и тогда разные компоненты клетки можно отличить друг от друга под микроскопом, не прибегая к окрашиванию. В этих микроскопах используют 2 пучка световых волн, которые взаимодействуют (налагаются) друг на друга, усиливая или уменьшая амплитуду волн, поступающих в глаз от разных компонентов клетки.

Конфокальный микроскоп и изображения, сделанные с его помощью: растрескивание пыльника, сосуды ксилемы, хлоропласты в клетках рыльца.

Световая микроскопия

Одним из главных методов цитологии на сегодняшний день остается микроскопия, предназначенная для изучения структуры клетки, она широко используется в фундаментальных и прикладных исследованиях. Изобретение микроскопа связывают с именами Галилео Галилея (итал.) и братьев Янсен (гол.) в 1609-1611 гг. Термин «микроскоп» был предложен Фабер (нем.) в 1625 г.

На настоящий момент существует два основных вида микроскопии - световая и электронная. Различия между ними состоят в принципе рассмотрения объекта. В первом случае объект рассматривают в потоке видимой части электромагнитного излучения (длина волны = 400-750 нм), во втором случае - в потоке электронов. Эти два метода имеют разную разрешающую способность. Разрешающая способность или предел разрешения - это минимальное расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно. Предел разрешения микроскопа задается длиной волны потока излучения, в котором изучается объект. Поэтому излучение данной длины волны может быть использовано для исследования только таких структур, минимальные размеры которых сопоставимы с длиной волны самого излучения. Предел разрешающей способности световой микроскопии был достигнут конструкторами микроскопов еще в конце 19 века, и составил 0,2 мкм. Это значит, что два объекта, если они разделены расстоянием менее 0,2 мкм, будут выглядеть как одно целое, даже если мы будем сильно увеличивать изображение, например, проецируя его на экран. Поэтому, с помощью светового микроскопа не удается рассмотреть две центриоли в клеточном центре, они выглядят как одна точка (надо сказать, что в современных микроскопах, производимых серийно, максимальная разрешающая способность не реализуется). В связи с ограничением разрешающей способности светового микроскопа он может быть использован для изучения ограниченного числа внутриклеточных структур, включая: ядро, пластиды, крупные вакуоли, оболочку растительной клетки. Мельчайшими объектами, четко различимыми в световом микроскопе являются бактерии и митохондрии, размеры которых составляют около 500 нм (0,5 мкм), более мелкие объекты видны нечетко, повышение точности обработки линз не может преодолеть это ограничение, которое задано волновой природой света.

Разрешающая способность зависит не только от длины волны источника освещения, но и от коэффициента преломления среды, через которую происходит наблюдение объекта, а также от угла наклона, под которым лучи освещения входят в объектив. Стандартный набор объективов микроскопа составляют: объективы малого увеличения (х8) с апертурой А=0,2 и объективы большого увеличения (х20) с А= 0,40 и - (х40) с А= 0,65. Эти объективы называют «сухими», так как рассмотрение объекта с их помощью происходит через воздушную среду (коэффициент преломления n=1). Но большинство микроскопов оснащены, кроме этого, специальными иммерсионными объективами, для которых необходима специальная иммерсионная среда (n=1). Такой средой может быть вода, объектив х40 ВИ имеет апертуру 0,75. Наиболее распространена масляная иммерсия (n=1,51), при х90 значение апертуры объектива А=1,25. В случае использования иммерсии улучшается разрешающая способность светового микроскопа. Однако, у объективов с высокой разрешающей способностью имеются недостатки: небольшая глубина резкости и невысокая контрастность.

Самым распространенным методом световой микроскопии является метод светлого поля, при котором световые лучи осветителя проходят через объект и попадают в объектив. Таким способом изучают клетки фиксированные и окрашенные. Открытие основных клеточных структур связано с разработкой и применением набора красителей, которые избирательно окрашивают компоненты клетки и обеспечивают контраст для их наблюдения. Имеется большое разнообразие красителей. Некоторые из них извлекаются из растений и животных, до сих пор не существует их синтетических аналогов. Например, широко используемый гематоксилин - экстракт тропического кампешевого дерева, кармин - пигмент жирового тела некоторых видов тлей. Все это так называемые ядерные красители, окрашивающие структуры, содержащие нуклеиновые кислоты. Применение неядерного красителя -азотнокислого серебра, позволило Камилло Гольджи в 1898 г. наблюдать и описать то, что позднее было названо аппаратом Гольджи.

Окрашивание живой клетки возможно лишь в редких случаях, поэтому для их изучения используют другие методы. В отличие от метода светлого поля при наблюдении объектов методом темного поля лучи осветителя не попадают в объектив и изображение создается только рассеянными лучами, идущими от объекта. При этом на темном фоне можно увидеть светящиеся частицы, которые по своим размерам меньше, чем разрешающая способность объектива, хотя размеры и форму частиц определить трудно. Темнопольная микроскопия в проходящем свете используется для изучения прозрачных объектов обычно невидимых в светлом поле и, особенно, для рассмотрения живых клеток. Совершенно по-разному на темном фоне выглядят живые и погибающие клетки. Протопласт погибающих клеток светится ярче, объяснения этому факту нет. Изобретен этот метод Зигмонди (австр.) в 1912 г. В световой микроскоп можно различать объекты, изменяющие амплитуду лучей освещения, однако живые клетки прозрачны для видимого света и лучи, проходя через клетку, практически не меняют амплитуды. Человеческий глаз не способен воспринимать смещение фазы лучей без изменения амплитуды. Поэтому специально для изучения живых клеток используются методы фазово-контрастной (изобретен Зернике (голл.) в 1934 г.) и интерференционной микроскопии (изобретен Лебедевым в 1932 г.). В таких системах прохождение света через живую клетку сопровождается изменением фазы световой волны. Свет задерживается, проходя через толстые участки клетки, например, через ядро. Возникает рекомбинация двух наборов волн, которые создают изображение клеточных структур.

Для изучения объектов, обладающих двойным лучепреломлением (крахмальные зерна, растительные волокна, кристаллы) используют поляризационную микроскопию, основы которой заложил Эбнер в 1882 г. В этом методе используют специальное устройство поляризатор, который преобразует разнонаправленные волны света и они приобретают одно направление.

При флуоресцентной микроскопии объект рассматривают в свете, излучаемом им самим. Первый люминесцентный микроскоп сконструировали Келлер и Зиндентокф в 1908 г. В основе этого метода лежит способность ряда веществ, при освещении коротковолновыми лучами (фиолетовыми или ультрафиолетовыми), светиться. Часто люминесцентная микроскопия используется для выявления специфических белков, антител, впервые использовал флуорохромы для связывания с антителами Кунс, и эта реакция получила его имя. В цитоэмбриологических исследованиях этот метод используют для изучения структур, содержащих углевод каллозу. Для этого метода используют специальную оптическую систему с ртутной лампой, связанную со световым микроскопом.

В последнее время возможности световой микроскопии существенно увеличились благодаря использованию чувствительных видеосистем. Изображение, созданное световым микроскопом, подвергается обработке в видеокамере. Оно очищается от «шумов», преобразуется в цифровые сигналы и направляется в компьютер, где подвергается дополнительной обработке для извлечения скрытой информации. Компьютерная интерференционная микроскопия позволяет достичь сильного контраста и анализировать прозрачные объекты и живые клетки.

Электронная микроскопия

Длительные непрерывные усилия по улучшению методов исследования принесли желаемые результаты в конце второй мировой войны. Именно тогда, благодаря удивительному стечению обстоятельств, почти в одно и то же время, ученые обогатились рядом новых мощных инструментов и методов исследования. В морфологии таким инструментом стал электронный микроскоп. Созданный еще в 30-е г. 20 века, он обладал достаточной разрешающей способностью, позволяющей проникнуть в клетку, вплоть до структур размером в нанометр. Вместе с тем, электронный пучок имел слабую проникающую способность, и это требовало приготовления очень тонких образцов материала и высокого вакуума. Такие жесткие требования создавали серьезные трудности, но в удивительно короткий срок удалось разработать методы для подготовки образцов тканей и сконструировать приборы для получения из них тонких срезов. Качество объектов неуклонно повышалось и к началу 60-ых годов были описаны многие из ранее неизвестных клеточных структур.

Итак, разрешающая способность электронного микроскопа намного выше, чем светового. Теоретически при напряжении 100000 В его разрешение составляет 0,002 нм, но за счет коррекции электронных линз оно уменьшается и в реальности составляет у современных электронных микроскопов 0,1 нм. Значительные трудности наблюдения биологических объектов еще более снижают нормальное разрешение, оно не превышает 2 нм. Тем не менее, это в 100 раз больше, чем у светового микроскопа, поэтому электронную микроскопию называют ультрамикроскопической.

Общая схема просвечивающего электронного микроскопа напоминает схему светового. Он существенно больше светового и как бы перевернут. В качестве источника излучения у электронного микроскопа служит нить катода, испускающая электроны (электронная пушка). Электроны испускаются с вершины цилиндрической колонны высотой около двух метров. Чтобы не было препятствий для движения электронов, происходит это в вакууме, разгоняются электроны анодом и проникают через крошечное отверстие в нижнюю часть колонны узким электронным лучом. Электронный луч фокусируется кольцевыми магнитами, расположенными вдоль колонны, они действуют подобно стеклянным линзам светового микроскопа. Образец помещается на пути электронного пучка. В момент его прохождения через образец часть электронов рассеивается в соответствии с плотностью вещества, остаток электронов фокусируется, образуя изображение на фотопластинке или на экране.

Первый электронный микроскоп был создан Сименсом в 1939 г. Он позволил увидеть в клетке множество удивительных структур. Но для этого пришлось изобрести совершенно новые методы приготовления препаратов, которые стали применять с 1952 г. Фиксация клеток при этом проводится глутаральдегидом, ковалентно связывающим белки, а затем осмиевой кислотой, стабилизирующей белковые и липидные слои. Образец обезвоживают и пропитывают смолами, образующими после полимеризации твердый блок. Срезы для электронной микроскопии должны быть примерно 1:200 часть толщины одной клетки. Для изготовления таких срезов был создан ультрамикротом (1953) , в котором используются стеклянные или алмазные ножи. Полученные срезы помещают на специальную медную сеточку. Изображение в электронном микроскопе зависит от рассеивания электронов, которое определяется атомным числом вещества. Биологические объекты состоят главным образом из углерода, кислорода и водорода, которые обладают низким атомным числом. Для усиления контраста их импрегнируют тяжелыми металлами, такими как осмий, уран, свинец. Тонкие срезы при просвечивающей электронной микроскопии не позволяют судить о трехмерной структуре клетки, компенсировать этот недостаток можно серией срезов, по которой проводится реконструкция клетки. Это долгий процесс.

Существует и прямой метод изучения трехмерного строения биологических объектов - сканирующая электронная микроскопия - она была создана в 1965 г. В этом случае для получения изображения используют электроны, рассеиваемые или излучаемые поверхностью объекта, который должен быть зафиксирован, высушен и покрыт пленкой тяжелого металла. Этот метод применим только для изучения поверхностей и его разрешение невелико - около 10 нм.

Электронный микроскоп

Просвечивающий, зондовый и растровый электронные микроскопы. Электронмикроскопическое изображение поверхности пыльника и пыльцевого зерна

Химические методы исследования клетки

Классический световой микроскоп обладает низкой разрешающей способностью, что не позволяет изучать детали строения клетки размером менее 0,25 мкм. Второй этап изучения клетки относится к тому времени, когда микроскописты трудились над усовершенствованием своих приборов. В это же время - конец 18 в. - французский ученый Антуан де Лавуазье и англичанин Джозеф Пристли создают новую науку - химию. В отличие от морфологии, которая развивается от сложного к простому, химия продвигается от простого к сложному. Начиналась химия с идентификации элементов, атомов и затем продвигалась по пути изучения некоторых их наиболее простых комбинаций - молекул.

Пересечь границу между неорганической и органической химией и позволить проникнуть в живой мир химии помог, впервые проведенный в 1828 г. Немецким ученым Фридрихом Велером, синтез биологической молекулы мочевины. Это стало началом применения химического подхода к изучению клетки. В последующие сто лет были открыты, очищены, структурно изучены и получены синтетическим путем аминокислоты, сахара, жиры, пурины, пиримидины и др. небольшие молекулы. Ученым удалось составить представление о метаболизме этих веществ в организме и путях образования из них основных биологических молекул: белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот. Но опять возникли труднопреодолимые препятствия на пути прогресса: перед сложностями структурной комплексности этих крупных молекул классическая химия оказалась бессильна. В течение длительного времени клетки изучали в основном путем наблюдения за ними. Но по мере развития экспериментального метода в естественных науках к нему начали прибегать и при исследовании живых организмов. Это облегчалось мощными биомедицинскими исследованиями проводимыми во второй половине 19 в. В начале 20 в. американец Росс Гаррисон и француз Алексис Каррель установили, что клетки животных можно культивировать в пробирке наподобие того как это делают с одноклеточными организмами. Тем самым они продемонстрировали способность клеток к независимой жизни и создали метод культивирования, который сейчас является одним из самых актуальных.

Но все эти методы, по сути революционные, по-прежнему, были непрямыми, клетка оставалась закрытым черным ящиком. Сохранялась неизведанной огромная пропасть между наименьшей различимой в световом микроскопе частицей и наиболее крупной молекулой, доступной химическому исследованию. В этом неизведанном пространстве были скрыты важные понятия и концепции, неизвестными оставались функции, описанных клеточных структур, их связь с известными биомолекулами - без всего этого жизнь клетки оставалась неразгаданной.

В свою очередь биохимия также обогатилась целым рядом принципиально новых приборов и методов. Особый интерес представляла хроматография, основанная на очень простом феномене - образовании каемки или ореола вокруг пятна (то, что мы видим, когда пытаемся вывести пятно специальным раствором). В основе этого явления лежат различия в скорости движения разных красок в потоке растекающейся жидкости. В начале 20 века русский физиолог и биохимик Михаил Семенович Цвет первым использовал этот феномен. Пропуская экстракт из листьев через вертикальную трубку, заполненную адсорбирующим порошком, он сумел разделить основные пигменты листьев - зеленый и оранжевый - и получить их в виде отдельных окрашенных полос или колец вдоль трубки. Свой метод он назвал хроматография (греч. khroma - цвет, graphein - записывать). Цвет умер относительно молодым и потенциальные возможности его метода оставались неиспользованными до начала 40-х гг. Сейчас существует множество вариантов хроматографии - применимой ко всем веществам, которые могут быть идентифицированы химически.

Близким к хроматографии является электрофорез в геле, при котором не поток растворителя, а электродвижущая сила способствует передвижению и разделению электрически заряженных компонентов. Эти методы произвели переворот в области химического анализа. Теперь на следовых количествах смеси практически любого состава можно провести анализ.

Вторым методом, радикально изменившем химическое исследование живых клеток, явился метод изотопного мечения. Изотопы - это разновидности одного и того же химического элемента, отличающиеся по атомной массе. Некоторые изотопы существуют в природе, многие могут быть получены искусственным путем в процессе ядерных реакций. Изотопы используются для специфического мечения определенных молекул, такие молекулы можно отличить от им родственных без нарушения общей структуры. Этот метод используется при анализе биосинтетических процессов, которые не могли быть изучены другим способом. Например, с получением меченых аминокислот появилась возможность изучать их соединение в белки в живом организме или в экспериментальных условиях, даже, несмотря на бесконечно малое количество вновь образованного белка, благодаря его радиоактивности. Широкое распространение этот метод получил с созданием атомных реакторов и производством широкого спектра радиоизотопов. Без метода меченых атомов достижения клеточной и молекулярной биологии были бы невозможны.

Таким образом, и морфология, и биохимия, обогащенные новыми методами постоянно совершенствовались, разрыв между их знанием становился все меньше и исчез совсем, когда появилась возможность разделить клетку на части таким образом, чтобы каждую часть можно было бы независимо изучить.

Методы, применяемые для такого фракционирования, основываются главным образом на центрифугировании. Этот метод использует различия в физических свойствах, в частности величине и плотности, тех или иных составных частей клетки для отделения их друг от друга. Это позволило изучить большую часть клетки и объединить морфологическое и биохимическое знание.

Однако одна часть клетки - ее важнейшая центральная часть, ядро - оставалась в значительной степени недоступной, пока не произошло еще одно событие. А началось оно с попытки проанализировать с помощью генетики особенности некоторых простых вирусов, инфицирующих бактерии и названные бактериофагами или пожирателями бактерий. Это исследование оказалось верным подходом к решению проблемы генетической организации, которая даже у простейших неклеточных организмов была необыкновенно сложной. Длительное время новая дисциплина известная сегодня как молекулярная биология, ограничивалась изучением вирусов и бактерий, но затем она буквально ворвалась в эукариотическую клетку, позволив изучать регуляцию жизнедеятельности клетки.

Для изучения молекулярных основ организации клетки необходим детальный биохимический анализ. Для него необходимо значительное количество клеток определенного типа, поэтому невозможно использовать кусочки ткани, ведь они содержат клетки разных типов. На первом этапе работы кусочки ткани превращают в суспензию. Это можно сделать, разрушив межклеточное вещество и межклеточные связи. Для этого ткань обрабатывают протеолитическими ферментами, разрушающими белки (трипсин, коллагеназа). В соединении клеток, их слипании большую роль играет кальций, поэтому используют и вещества хелатирующие, которые связывают кальций. Затем ткани подвергают мягкому механическому разрушению и разделяют на отдельные клетки. Второй этап - разделение суспензии на отдельные фракции. Для этого используют центрифугирование, с помощью которого крупные клетки отделяют от мелких, а легкие - от тяжелых или используют антитела, и способность клеток с разной прочностью прикрепляться к стеклу или пластмассе. Третий этап - введение выделенных клеток в культуру. Первые опыты были проведены в 1907 г. Гаррисоном, он культивировал спинной мозг амфибий в сгустке плазмы. Среды для культивирования имеют довольно сложный состав. Стандартная среда была разработана в начале 70-х, она содержит набор из 13 аминокислот, 8 витаминов, минеральные соли. Кроме того, в среду могут включаться глюкоза, пенициллин, стрептомицин, сыворотка лошади или теленка. Как показали Хайфлик и Мурхед в 1961 г., большинство клеток млекопитающих погибает в культуре после определенного числа делений. Клетки кожи человека делятся в культуре 50-100 раз. Однако в культуре иногда появляются мутантные клетки, которые могут размножаться бесконечно, образуя клеточную линию. В 1952 г. была выделена перевиваемая клеточная линия из раковой опухоли шейки матки, известная как линия HeLa. Такие линии хранят при температуре -70 С, после размораживания они сохраняют способность делиться. Метод культивирования растительных клеток был разработан к 1964 г. Пользуясь им, удалось вырастить in vitro целое растение моркови из клеток корня.