Изследването на потискането на ензимната активност е един от начините за дешифриране на механизма на тяхното действие. Подход за решаване на последния проблем е изследване на спецификата на действието на ензимите. Това от своя страна изисква правилно измерване на кинетичните параметри в присъствието на изследвания аналог на субстрата. Помислете за начините за определяне естеството на връзкатасубстрати, техните аналози и инхибитори на ензимната активност чрез изчисляване на редица кинетични параметри.
Освен това, ако константата на дисоциация на комплекса K s = K m е равна на:
ИнхибиториЕнзимите могат да бъдат разделени на две основни групи: обратимоИ необратими.След отстраняването на първия тип инхибитор, активността на ензима се възстановява; във втория случай инхибиторът не може да бъде отстранен или активността на ензима не се възстановява дори след отстраняването на инхибитора. Необратимото инхибиране се максимизира, когато целият ензим е свързан с инхибитора. Обратимото инхибиране достига равновесно състояние, чието положение се определя от константа на инхибиранехарактеризиращ афинитета на ензима към инхибитора. Схемата за обратимо инхибиране е показана по-долу:
При конкурентно инхибиране, субстратът и инхибиторът се свързват към едно и също активно място на ензима. В присъствието на инхибитор афинитетът на ензима към субстрата намалява. Стойността не се променя, тъй като при „насищаща“ концентрация субстратът измества инхибитора от комплекса с ензима.
В неконкурентно инхибиране субстратът и инхибиторът се свързват с различни места на ензима. В този случай стойността на K ha не се променя, а стойността на V max намалява.
Възможни са и междинни или алтернативни случаи, например, когато инхибиторът се свързва не с ензима, а с комплекса ензим-субстрат, както в случая неконкурентоспособенинхибиране, при което и двата кинетични параметъра се променят.
За определяне на вида на инхибирането обикновено се използва графика на Lineweaver-Burk, получен за даден субстрат в отсъствието и присъствието на инхибитор.
При конкурентно инхибиране, ако стойността на Kt се определя в присъствието на инхибитор, константата на инхибиране може да се изчисли по следната формула:
При неконкурентно инхибиране, чрез определяне на променената стойност на V, K може да се изчисли по следната формула:
Всички биохимични процеси в клетката са взаимосвързани и взаимозависими, но някои от тях изпълняват основно функцията на изграждане на клетъчен материал, а някои от тях осигуряват енергийни източници за тези „строителни работи“. Поради това е обичайно биохимичните процеси да се разделят на два основни типа: асимилация,Наречен анаболизъм,включително синтеза на прекурсори с ниско молекулно тегло и изграждането на биополимерни молекули от тях, и дисимилация,Наречен катаболизъмсъстояща се в осигуряване на източник на енергия, "енергиен двигател", който задвижва анаболизма.
Нека разгледаме основните механизми на процесите на енергийна трансформация в клетката, т.е. механизми на катаболни процеси.
Разграничаване на обратимо и необратимо инхибиране. Ако инхибиторът причинява постоянни промени в пространствената третична структура на ензимната молекула или модификация на функционалните групи на ензима, тогава този тип инхибиране се нарича необратимо. По-често обаче има обратимо инхибиране, което може да бъде количествено изследвано на базата на уравнението на Michaelis-Menten. Обратимото инхибиране от своя страна се разделя на конкурентно и неконкурентно, в зависимост от това дали е възможно да се преодолее инхибирането на ензимната реакция чрез увеличаване на концентрацията на субстрата.
Конкурентното инхибиране може да бъде причинено от вещества, които имат структура, подобна на структурата на субстрата, но малко по-различна от структурата на истинския субстрат. Такова инхибиране се основава на свързването на инхибитора към субстрат-свързващото (активно) място. Класически пример за този тип инхибиране е инхибирането на сукцинат дехидрогеназата (SDH) от малонова киселина. Този ензим катализира окисляването чрез дехидрогениране на янтарна киселина (сукцинат) до фумарова киселина:
Ако към средата се добави малонат (инхибитор), тогава в резултат на структурното му сходство с истинския субстрат сукцинат (наличието на две от едни и същи йонизирани карбоксилни групи), той ще взаимодейства с активното място, за да образува ензим-инхибитор комплекс, обаче, прехвърлянето на водороден атом от малонат е напълно изключено. Структурите на субстрата (сукцинат) и инхибитора (малонат) са малко по-различни. Следователно те се конкурират за свързване с активното място и степента на инхибиране ще се определя от съотношението на концентрациите на малонат и сукцинат, а не от абсолютната концентрация на инхибитора. По този начин, инхибиторът може да бъде обратимо свързан от сферата, образувайки комплекс ензим-инхибитор. Този тип инхибиране понякога се нарича инхибиране на метаболитен антагонизъм (Фигура 4.20).
IN обща формаРеакцията на взаимодействие на инхибитор с ензим може да бъде представена със следното уравнение:
Полученият комплекс, наречен комплекс ензим-инхибитор EI, за разлика от ензимно-субстратния комплекс ES, не се разлага с образуването на реакционни продукти. Константата на дисоциация на EI комплекса, или инхибиторната константа K i , може, следвайки теорията на Michaelis-Menten, да се дефинира като съотношение на обратната и директната реакционна константа:
Методът на конкурентното инхибиране е намерил широко приложение в медицинската практика. Известно е, например, че сулфаниламидни препарати се използват за лечение на някои инфекциозни заболявания, причинени от бактерии. Оказа се, че тези лекарства имат структурно сходство с парааминобензоената киселина, която бактериална клеткаизползва за синтеза на фолиева киселина, която е неразделна част
Ориз. 4.20.Действието на конкурентен инхибитор (схема според V.L. Kretovich). Е - ензим; S - субстрат; R1 и R2 - реакционни продукти; I - инхибитор.
бактериални ензими. Поради това структурно сходство, сулфаниламидът блокира действието на ензима, като измества парааминобензоената киселина от комплекса с ензима, който синтезира фолиева киселина, което води до инхибиране на бактериалния растеж.
Неконкурентното инхибиране се причинява от вещества, които нямат структурни сходства със субстратите и често се свързват не с активното място, а с друго място в ензимната молекула. Степента на инхибиране в много случаи се определя от продължителността на действието на инхибитора върху ензима. При този вид инхибиране, поради образуването на стабилна ковалентна връзкаензимът често претърпява пълно инактивиране и след това инхибирането става необратимо. Пример за необратимо инхибиране е действието на йодоацетат, DPP, както и диетил-р-нитрофенил фосфат и соли на циановодородната киселина. Това действие се състои в свързване и изключване на функционалните групи или металните йони и ензимната молекула.
ограничена протеолиза.
Регулиране на активността от хормони.
Хормоналната регулация се осъществява на генетично ниво чрез обратимо фосфорилиране. Например, под действието на адреналина се активира процесът на разграждане на гликоген. По време на този процес се образува непротеиново съединение, y-AMP. γ-AMP е вътреклетъчен хормон (втори пратеник), който е алостеричен регулатор на голям брой протеинови липази. γ-AMP се образува от АТФ под действието на аденилат циклази.
Регулиране на активността чрез химическа модификация.
Химическа модификация- свързването на всякакви функционални групи към ензима, с последваща промяна в неговата активност. Химическата модификация е обратима. Например, ключовите ензими на енергийния метаболизъм - фосфорилаза, гликоген синтаза се контролират чрез фосфорилиране и дефосфорилиране, осъществявани от специфични ензими - протеиназа и фосфотаза. И нивото на активност на ключовите ензими ще се определя от съотношението на фосфорилираните и дефосфорилираните форми на тези ензими.
Всички ензими на стомашно-чревния тракт и панкреаса се синтезират в неактивна форма под формата на проензими. Регулирането в този случай се свежда до превръщането им в активна форма. Например, активирането на трипсиноген става под действието на ентерокиназа и води до разцепване на излишната аминокиселинна последователност. В този случай се получава образуването на активния център и третичната структура на трипсина. Това явление е наречено ограничена протеолиза . Биологичното му значение се крие във факта, че изключва самосмилането на органа (автокатализа), което например се получава при активиране на трипсин в самия панкреас. Второ, осигурява се по-фина регулация на количеството на ензима.
Ограничената протеолиза е под контрола на факторите на околната среда, pH, в клетката - под контрола на Ca.
Скоростта на ензимната реакция се определя от наличието на ефектори в средата: активатори и инхибитори. Активатори увеличават скоростта на реакцията и понякога я променят, докато инхибиторите я забавят.
Активатори: коензими, Ме йони, SH-реактиви. Активиращият ефект е свързан с оптимизирането на структурата на протеиновата молекула и активния център на ензима. Това подобрява взаимодействието между ензима и субстрата.
Активатор на панкреатична липаза - жлъчни киселини.
Активатор на трипсиноген - ентерокиназа.
Активатор на хематрипсиноген - трипсин.
Активатор на пепсин и амилаза - Са йони.
Аз също мога да действам като активатори:
Zn е активатор на карбоанхидразата.
ИнхибиториОбичайно е да се наричат вещества, които причиняват частично или пълно инхибиране на реакцията.
Всички агенти, които причиняват денатурация на ензима, са инхибитори. Такова инхибиране обаче е неспецифично, тъй като не е свързано с механизма на действие на ензима. Има много повече специфични инхибитори, които действат върху един конкретен ензим или върху група от свързани ензими. Такива инхибитори могат да предоставят ценна информация за естеството на активното място на ензима. Механизмът на действие на много токсини и отрови върху тялото се основава на инхибирането на ензимите. Така че в случай на отравяне с циановодородна киселина възниква спазъм поради пълно инхибиране на дихателните ензими (цитохром оксидаза).
Видове инхибиране:
1) Обратима
2) Необратима
Ако инхибиторна молекула причинява постоянни промени или модификация на активното място на ензима, тогава такива вид инхибиране Наречен необратими .
Обратимото инхибиране е по-често срещано и се разделя на конкурентниИ неконкурентни, в зависимост от това дали е възможно да се преодолее инхибирането на ензимната реакция чрез увеличаване (S). Конкурентното инхибиране е възможно, ако има структурно сходство между субстрата и инхибитора. Например, инхибиране на активността на сукцинат дехидрогеназа от малонова киселина:
NOOS - 2N NOOS
CH -------- CH
CH SDG CH
NOOS NOOS
сукцинат фумарат
Ако малонатът се въведе в средата вместо сукцинат, тогава поради структурното му сходство със сукцинат, той ще реагира с активния център на SDH. В този случай обаче 2H трансфер от малонат не се случва, тъй като структурите на малонат и сукцинат все още са малко различни и те ще се конкурират за свързване с активния център на SDH, а степента на инхибиране ще се определя от съотношението на концентрациите на малонат и сукцинат. Характеристика на това инхибиране е обратимостта поради увеличаване на (S).
I(+) E + I ------ EI
Често се наблюдава частично неконкурентно инхибиране, при което намаляването на Vmax се комбинира с увеличаване на Km. В редки случаи степента на инхибиране на ензимната активност може да се увеличи с увеличаване (S). Това т.нар неконкурентно инхибиране . В този случай е възможно инхибиторът да се комбинира с ES комплекса, следователно се образува неактивен или бавно реагиращ комплекс.
ES+I------ESI
Действието на много лекарства се основава на всички тези методи на инхибиране. Например, сулфа лекарствата се използват за лечение на определени инфекции, които са структурно подобни на PABA, които бактериалната клетка използва като субстрат за синтеза на фолиева киселина. Поради сходството, сулфаниламидът блокира действието на ензима, като измества PABA от ES комплекса, което води до намаляване на бактериалния растеж. Това конкурентно инхибиране .
Всички биохимични реакции, протичащи в организма, подлежат на специфичен контрол, който се осъществява чрез активиращ или инхибиращ ефект върху регулаторните ензими. Последните обикновено са в началото на вериги от метаболитни трансформации и или започват многоетапен процес, или го забавят. Някои единични реакции също подлежат на регулиране. Конкурентното инхибиране е един от основните механизми за контролиране на каталитичната активност на ензимите.
Механизмът на ензимната катализа се основава на свързването на активното място на ензима със субстратната молекула (ES комплекс), което води до химическа реакцияс образуването и освобождаването на продукта (E+S = ES = EP = E+P).
Ензимното инхибиране е намаляване на скоростта или пълно спиране на процеса на катализа. В по-тесен смисъл този термин означава намаляване на афинитета на активния център към субстрата, което се постига чрез свързване на ензимни молекули с инхибиторни вещества. Последните могат да действат по различни начини, въз основа на което се разделят на няколко типа, които съответстват на едноименните механизми на инхибиране.
Основни видове инхибиране
Според естеството на процеса инхибирането може да бъде два вида:
- Необратимо - причинява постоянни промени в ензимната молекула, лишавайки я от функционална активност (последната не може да бъде възстановена). Тя може да бъде специфична или неспецифична. Инхибиторът се свързва силно с ензима чрез ковалентно взаимодействие.
- Обратимото е основният вид отрицателна регулация на ензимите. Осъществява се поради обратимото специфично прикрепване на инхибитора към протеин-ензима чрез слаби нековалентни връзки, поддаващи се на кинетично описание съгласно уравнението на Михаелис-Ментен (с изключение на алостеричната регулация).
Има два основни типа обратимо ензимно инхибиране: конкурентно (може да бъде отслабено чрез увеличаване на концентрацията на субстрата) и неконкурентно. В последния случай максимално възможната скорост на катализа намалява.
Основната разлика между конкурентното и неконкурентното инхибиране се крие в мястото на прикрепване на регулаторното вещество към ензима. В първия случай инхибиторът се свързва директно с активното място, а във втория - с друго място на ензима или с комплекса ензим-субстрат.
Съществува и смесен тип инхибиране, при който свързването с инхибитор не предотвратява образуването на ES, а забавя катализата. В този случай регулаторното вещество е в състава на двойни или тройни комплекси (EI и EIS). При неконкурентния тип ензимът се свързва само с ES.
Характеристики на обратимо конкурентно инхибиране на ензимите
Конкурентният механизъм на инхибиране се основава на структурното сходство на регулаторното вещество със субстрата. В резултат на това се образува комплекс от активното място с инхибитора, условно обозначен като EI.
Обратимото конкурентно инхибиране има следните характеристики:
- свързването с инхибитора се осъществява в активното място;
- инактивирането на ензимната молекула е обратимо;
- инхибиторният ефект може да бъде намален чрез увеличаване на концентрацията на субстрата;
- инхибиторът не влияе на максималната скорост на ензимната катализа;
- EI комплексът може да се разложи, което се характеризира със съответната константа на дисоциация.
При този тип регулация инхибиторът и субстратът сякаш се конкурират (конкурират) един с друг за място в активния център, откъдето идва и името на процеса.
В резултат на това конкурентното инхибиране може да се дефинира като обратим процес на инхибиране на ензимната катализа въз основа на специфичния афинитет на активното място към инхибиторното вещество.
Механизъм на действие
Свързването на инхибитора с активното място предотвратява образуването на ензим-субстратния комплекс, необходим за катализа. В резултат на това ензимната молекула става неактивна. Независимо от това, каталитичният център може да се свърже не само с инхибитора, но и със субстрата. Вероятността за образуване на един или друг комплекс зависи от съотношението на концентрациите. Ако има значително повече субстратни молекули, тогава ензимът ще реагира с тях по-често, отколкото с инхибитора.
Влияние върху скоростта на химическа реакция
Степента на инхибиране на катализа по време на конкурентно инхибиране се определя от количеството ензим, който ще образува EI комплекси. В този случай е възможно да се увеличи концентрацията на субстрата до такава степен, че ролята на инхибитора да бъде заменена, а скоростта на катализа да достигне максимално възможната стойност, съответстваща на стойността на V max според Michaelis- уравнение на Ментен.
Това явление се обяснява със силно разреждане на инхибитора. В резултат на това вероятността ензимните молекули да се свържат с него е намалена до нула и активните центрове реагират само със субстрата.
Кинетични зависимости на ензимната реакция с участието на конкурентен инхибитор
Конкурентното инхибиране увеличава константата на Михаелис (Km), която е равна на концентрацията на субстрата, необходима за постигане на ½ от максималната скорост на катализа в началото на реакцията. Количеството на ензима, хипотетично способен да се свърже със субстрата, остава постоянно, докато броят на реално образуваните ES комплекси зависи само от концентрацията на последния (EI комплексите не са постоянни и могат да бъдат изместени от субстрата).
Конкурентното инхибиране на ензимите може лесно да се определи от графики на кинетична зависимост, нанесени за различни концентрации на субстрата. В този случай стойността на K m ще се промени, а V max ще остане постоянен.
При неконкурентното инхибиране е вярно обратното: инхибиторът се свързва извън активното място и присъствието на субстрата не може да повлияе на това по никакъв начин. В резултат на това някои от ензимните молекули се „изключват“ от катализа и максималната възможна скорост намалява. Въпреки това, активните ензимни молекули могат лесно да се свързват със субстрата както при ниски, така и при високи концентрации на последния. Следователно константата на Михаелис остава постоянна.
Графиките на конкурентното инхибиране в системата от двойни обратни координати са няколко прави линии, пресичащи оста y в точката 1/V max . Всяка права линия съответства на определена концентрация на субстрата. Различни точки на пресичане с оста на абсцисата (1/[S]) показват промяна в константата на Михаелис.
Действието на конкурентен инхибитор на примера на малоната
Типичен пример за конкурентно инхибиране е процесът на намаляване на активността на сукцинат дехидрогеназата, ензим, който катализира окисляването на янтарна киселина (сукцинат) до фумарова киселина. Инхибиторът тук е малонат, който е структурно подобен на сукцинат.
Добавянето на инхибитор към средата причинява образуването на комплекси от малонат със сукцинат дехидрогеназа. Такава връзка не причинява увреждане на активното място, но блокира достъпа му до янтарна киселина. Увеличаването на концентрацията на сукцинат намалява инхибиторния ефект.
Използване в медицината
Механизмът на конкурентното инхибиране е в основата на действието на много лекарства, които са структурни аналози на субстратите на някои метаболитни пътища, чието инхибиране е необходима част от лечението на заболявания.
Например, за да се подобри проводимостта на нервните импулси при мускулни дистрофии, е необходимо да се повиши нивото на ацетилхолин. Това се постига чрез инхибиране на активността на неговата хидролизираща ацетилхолинестераза. Като инхибитори действат кватернерните амониеви бази, които са част от лекарствата (прорезин, ендофоний и др.).
В специална група се разграничават антиметаболити, които в допълнение към инхибиторния ефект проявяват свойствата на псевдосубстрат. В този случай образуването на EI комплекса води до образуването на биологично инертен аномален продукт. Антиметаболитите включват сулфонамиди (използвани при лечението на бактериални инфекции), нуклеотидни аналози (използвани за спиране на клетъчния растеж на раков тумор) и др.
Конкурентно инхибиране: определение, характеристики и примери - всичко за пътуването в сайта
При определени условия инхибиторът може лесно да се отдели от ензима.
Конкурентно обратимо инхибиране
В този случай вещество, което е подобно по структура на обичайния субстрат на ензима, се комбинира с активния център на ензима, но не може да реагира с него. Намирайки се тук, той блокира достъпа до активния център на всяка молекула от истинския субстрат. Тъй като в този случай инхибиторът и субстратът се конкурират за място в активното място на ензима, тази форма на инхибиране се нарича конкурентно инхибиране. Той е обратим, тъй като скоростта на реакцията се увеличава с увеличаване на концентрацията на субстрата.
6.4. Защо скоростта на реакцията се увеличава при тези условия?
Ориз. 6.15 илюстрира един пример за конкурентно инхибиране.
Феноменът конкурентно инхибиране се използва в химиотерапия. Целта на химиотерапията е да унищожи причинителя на заболяването с помощта на определени химикали, без да уврежда тъканите на организма гостоприемник. По време на Втората световна война те са били широко използвани за борба с инфекциозни заболявания. сулфа лекарства, или сулфонамиди, - производни на сулфанилова киселина. Сулфонамидите по своята химическа структура са близки до пара-аминобензоената киселина (PABA) – основен растежен фактор за много патогенни бактерии. PABA се изисква от бактериите за синтеза на фолиева киселина, която служи като техен ензимен кофактор. Действието на сулфонамидите е свързано с нарушение на синтеза на фолиева киселина от PABA.
Животинските клетки не са чувствителни към сулфонамиди, въпреки че изискват фолиева киселина за някои реакции. Това се обяснява с факта, че използват преобразувана фолиева киселина; метаболитният път, който би осигурил неговия синтез, липсва при животните.
Неконкурентно обратимо инхибиране
Инхибиторите от този род не са структурно свързани със субстрата на този ензим; в този случай в образуването на комплекса с инхибитора участва не активният център на ензима, а някаква друга част от неговата молекула (фиг. 6.16). Образуването на комплекса води до промяна в глобуларната структура на ензима и въпреки че истинският субстрат все още е прикрепен към ензима, катализата все пак се оказва невъзможна. Пример е цианидът. Той се свързва с метални йони, които действат като простатична група в някои ензими (по-специално с медни йони на цитохром оксидазата) и инхибира активността на тези ензими. С увеличаване на концентрацията на инхибитора скоростта на ензимната реакция намалява все повече и повече. До момента на насищане с инхибитора той се оказва практически равен на нула.
