Малки интерфериращи РНК не са включени. Малки РНК и рак. Етика духовност онкология hiv p garyaev* a enfi резюме

Разрушаването на прицелната иРНК може да се случи и под действието на малка интерферираща РНК (Small interfering RNA, siRNA). РНК интерференцията е едно от новите революционни открития в молекулярната биология и нейните автори получиха Нобелова награда през 2002 г. за нея. Интерфериращите РНК се различават рязко по структура от другите видове РНК и представляват две комплементарни РНК молекули с дължина приблизително 21-28 азотни бази, които са свързани една с друга като вериги в ДНК молекула. В същото време два несдвоени нуклеотида винаги остават в краищата на всяка от веригите на siRNA. Въздействието се извършва по следния начин. Когато молекулата siRNA е вътре в клетката, на първия етап тя се свързва в комплекс с два вътреклетъчни ензима - хеликаза и нуклеаза. Този комплекс се наричаше RISC ( РНЕ- ииндуциран с ilencing ° Скомплекс; мълчание - англ мълчи, мълчи; Silence – мълчание, както се нарича процесът на „изключване“ на ген в английската и специалната литература). След това хеликазата се развива и разделя вериги на siRNA и една от нишките (антисенс в структурата) в комплекс с нуклеазата специфично взаимодейства с комплементарния (стриктно съответстващ на него) сайт на целевата иРНК, което позволява на нуклеазата да я отреже на две части. Изрязаните участъци от иРНК са допълнително изложени на действието на други клетъчни РНК нуклеази, които допълнително ги нарязват на по-малки парчета.

siRNAs, открити в растенията и нисшите животински организми (насекоми), са важна връзка в един вид „вътреклетъчен имунитет“, който прави възможно разпознаването и бързото унищожаване на чужда РНК. В случай, че вирус, съдържащ РНК, влезе в клетката, такава защитна система ще предотврати размножаването й. Ако вирусът съдържа ДНК, системата siRNA ще попречи на производството му на вирусни протеини (тъй като необходимата за това иРНК ще бъде разпозната и отрязана) и използването на тази стратегия ще забави разпространението му в тялото. Установено е, че системата siRNA е изключително дискриминираща: всяка siRNA ще разпознае и унищожи само своята собствена специфична иРНК. Заместването само на един нуклеотид в siRNA води до рязко намаляване на интерференционния ефект. Нито един от известните досега генни блокери няма такава изключителна специфичност по отношение на своя целеви ген.

В момента този метод се използва главно в научни изследвания за идентифициране на функциите на различни клетъчни протеини. Въпреки това, потенциално може да се използва и за създаване на лекарства.

Откриването на РНК интерференцията даде нова надежда в борбата срещу СПИН и рак. Възможно е чрез използване на siRNA терапия заедно с традиционните антивирусни и противоракови терапии да се постигне ефект на потенциране, когато две лечения водят до по-изразен терапевтичен ефект от простата сума на всяко от тях, приложено поотделно.

За да се използва механизмът на siRNA-интерференция в клетките на бозайници за терапевтични цели, готови двуверижни siRNA молекули трябва да бъдат въведени в клетките. Съществуват обаче редица проблеми, които в момента не позволяват това да се направи на практика и още повече да се създадат някакви лекарствени форми. Първо, в кръвта те са засегнати от първия ешелон на защитата на тялото, ензими - нуклеази, които отрязват потенциално опасни и необичайни двойни нишки РНК за нашето тяло. Второ, въпреки името си, малките РНК са все още доста дълги и най-важното е, че носят отрицателен електростатичен заряд, което прави невъзможно пасивното им проникване в клетката. И трето, един от най-важните въпроси е как да накараме siRNA да работи (или да проникне) само в определени („болни“) клетки, без да засяга здравите? И накрая проблемът с размера. Оптималният размер на такива синтетични siRNAs е същите 21-28 нуклеотида. Ако увеличите дължината му, клетките ще реагират с производството на интерферон и намаляване на протеиновия синтез. От друга страна, ако се опитате да използвате siRNA, по-малка от 21 нуклеотида, специфичността на нейното свързване с желаната иРНК и способността за образуване на RISC комплекс са рязко намалени. Трябва да се отбележи, че преодоляването на тези проблеми е от решаващо значение не само за siRNA терапията, но и за генната терапия като цяло.

Вече е постигнат известен напредък в справянето с тях. Например, учените се опитват да направят молекулите на siRNA повече липофилен, тоест способни да се разтварят в мазнините, които изграждат клетъчната мембрана, и по този начин да улеснят проникването на siRNA в клетката. И за да осигурят специфичността на работата само в определени тъкани, генните инженери включват специални регулаторни региони в своите структури, които се активират и започват да четат информацията, съдържаща се в такава структура (и следователно siRNA, ако е включена там), само в клетки на определени тъкани.

Така изследователи от Медицинското училище в Сан Диего към Калифорнийския университет (University of California, San Diego School of Medicine) са разработили нова ефективна система за доставяне на малка интерферираща РНК (siRNA), която потиска производството на определени протеини, в клетките . Тази система трябва да стане основа за технологията за доставяне на специфично лекарство към различни видове ракови тумори. „Малки интерфериращи РНК, които осъществяват процеса на така наречената РНК интерференция, имат невероятен потенциал за лечение на рак“, обяснява професор Стивън Дауди, който ръководи изследването: „и въпреки че все още имаме много да правим, в момента ние са разработили технологията за доставка на лекарства до популация от клетки - както първичен тумор, така и метастази, без да увреждат здравите клетки.

В продължение на много години Дауди и неговите колеги изучават противораковия потенциал на малки интерфериращи РНК. Въпреки това, конвенционалните siRNAs са малки, отрицателно заредени молекули, които поради своите свойства са изключително трудни за доставяне в клетката. За да постигнат това, учените използваха късия сигнален протеин PTD (пептиден трансдукционен домейн). Повече от 50 "хибридни протеини" бяха създадени преди това с неговото използване, в които PTD беше комбиниран с протеини, потискащи туморния растеж.

Въпреки това, простата връзка на siRNA с PTD не води до доставянето на РНК в клетката: siRNAs са отрицателно заредени, PTDs са положително заредени, което води до образуването на плътен РНК-протеинов конгломерат, който не се транспортира през клетъчната мембрана . Така изследователите първо свързаха PTD с протеинова РНК-свързващ домен, който неутрализира отрицателния заряд на siRNA (в резултат на слят протеин, наречен PTD-DRBD). Такъв РНК-протеинов комплекс вече лесно преминава през клетъчната мембрана и навлиза в клетъчната цитоплазма, където специфично инхибира протеините на информационната РНК, които активират туморния растеж.

За да определят способността на слетия протеин PTD-DRBD да доставя siRNA в клетките, учените са използвали клетъчна линия, получена от човешки рак на белия дроб. След третиране на клетки с PTD-DRBD-siRNA беше установено, че туморните клетки са най-податливи на siRNA, докато в нормалните клетки (като контроли са използвани Т-клетки, ендотелни клетки и ембрионални стволови клетки), където няма повишени производство на онкогенни протеини, не са наблюдавани токсични ефекти.

Този метод може да бъде подложен на различни модификации, като се използват различни siRNAs за потискане на различни туморни протеини, не само свръхпродуцирани, но и мутирали. Възможно е също така да се модифицира терапията в случай на рецидив на тумори, които обикновено стават резистентни към химиотерапевтичните лекарства поради нови мутации.

Онкологичните заболявания са много променливи, а молекулярните характеристики на протеините на туморните клетки са индивидуални за всеки пациент. Авторите на работата смятат, че в тази ситуация използването на малки интерфериращи РНК е най-рационалният подход към терапията.

В жива клетка потокът от информация между ядрото и цитоплазмата никога не пресъхва, но разбирането на всичките й „обратки“ и дешифрирането на информацията, кодирана в нея, е наистина титанична задача. Един от най-важните пробиви в биологията на миналия век може да се счита за откриването на информационни (или шаблонни) РНК молекули (мРНК или иРНК), които служат като посредници, които пренасят информационни „съобщения“ от ядрото (от хромозомите) до цитоплазма. Решаващата роля на РНК в протеиновия синтез е предсказана още през 1939 г. в работата на Торбьорн Касперсон ( Торбьорн Касперсон), Жан Браше ( Жан Браше) и Джак Шулц ( Джак Шулц), а през 1971 г. от Джордж Марбейс ( Джордж Марбе) задейства синтеза на хемоглобин в жабешки ооцити чрез инжектиране на първата изолирана РНК на заек, кодираща този протеин.

През 1956–1957 г. в Съветския съюз А. Н. Белозерски и А. С. Спирин независимо доказаха съществуването на иРНК и също така установиха, че по-голямата част от РНК в клетката в никакъв случай не е матрична, а рибозомна РНК(рРНК). Рибозомната РНК - вторият "основен" тип клетъчна РНК - образува "скелета" и функционалния център на рибозомите във всички организми; именно рРНК (а не протеините) регулира основните етапи на протеиновия синтез. В същото време беше описан и проучен третият „основен” тип РНК – трансферна РНК (тРНК), която в комбинация с другите два – иРНК и рРНК – образуват единен протеин-синтезиращ комплекс. Според доста популярната хипотеза за "света на РНК", именно тази нуклеинова киселина лежи в началото на живота на Земята.

Поради факта, че РНК е много по-хидрофилна от ДНК (поради заместването на дезоксирибоза с рибоза), тя е по-лабилна и може да се движи относително свободно в клетката и следователно да доставя краткотрайни реплики на генетична информация (иРНК) на мястото, където се синтезира протеин. Въпреки това си струва да се отбележи „неудобството“, свързано с това - РНК е много нестабилна. Съхранява се много по-лошо от ДНК (дори вътре в клетката) и се разгражда при най-малката промяна в условията (температура, pH). В допълнение към "собствената" нестабилност, голям принос имат рибонуклеазите (или РНКазите) - клас ензими, разцепващи РНК, много стабилни и "вездесъщи" - дори кожата на ръцете на експериментатора съдържа достатъчно количество от тези ензими за преминаване извади целия експеримент. Поради това работата с РНК е много по-трудна, отколкото с протеини или ДНК – последните обикновено могат да се съхраняват стотици хиляди години с малко или никакво увреждане.

Фантастична точност по време на работа, три дестилат, стерилни ръкавици, лабораторни съдове за еднократна употреба - всичко това е необходимо, за да се предотврати разграждането на РНК, но спазването на такива стандарти не винаги е било възможно. Следователно дълго време късите „фрагменти“ от РНК, които неизбежно замърсяват разтворите, просто бяха игнорирани. С течение на времето обаче стана ясно, че въпреки всички усилия за поддържане на стерилността на работната зона, „отломките“ естествено продължават да се откриват и след това се оказва, че винаги има хиляди къси двуверижни РНК в цитоплазмата които изпълняват доста специфични функции и са абсолютно необходими за нормалното развитие.клетки и организми.

Принцип на РНК интерференция

Фармацевтите също се интересуват от възможността за използване на siRNA, тъй като способността за директно регулиране на работата на отделните гени обещава нечувани перспективи при лечението на множество заболявания. Малкият размер и високата специфичност на действие обещават висока ефикасност и ниска токсичност на лекарствата, базирани на siRNA; все пак реши проблема доставка siRNA към болните клетки в тялото все още не е успяла - причината за това е крехкостта и крехкостта на тези молекули. И въпреки че сега десетки екипи се опитват да намерят начин да насочат тези „магически куршуми“ точно към целта (вътре в болните органи), те все още не са постигнали видим успех. Освен това има и други трудности. Например, в случай на антивирусна терапия, високата селективност на действието на siRNA може да бъде лоша услуга - тъй като вирусите бързо мутират, модифицираният щам много бързо ще загуби чувствителност към siRNA, избрана в началото на терапията: известно е, че заместването само на една нуклеотид в siRNA води до значително намаляване на интерференционния ефект.

В този момент си струва да си припомним още веднъж - бяха открити siRNA само при растения, безгръбначни и едноклетъчни; Въпреки че хомолози на протеини за РНК интерференция (Dicer, RISC комплекс) също присъстват във висши животни, siRNAs не са открити чрез конвенционални методи. Каква изненада беше, когато изкуствено въведениСинтетичните аналози на siRNA произвеждат силен специфичен дозо-зависим ефект в клетъчни култури от бозайници! Това означаваше, че в клетките на гръбначните животни, РНК интерференцията не е заменена от по-сложни имунни системи, а еволюира заедно с организмите, превръщайки се в нещо по-„напреднало“. Следователно при бозайниците беше необходимо да се търсят не точни аналози на siRNA, а техните еволюционни наследници.

Играч #2 - miRNA

Всъщност, въз основа на еволюционно доста древния механизъм на РНК интерференция, по-развитите организми са разработили две специализирани системи за контрол на работата на гените, като всяка използва своя собствена група от малки РНК - miRNA(микроРНК) и piRNA(piRNA, Piwi-взаимодействаща РНК). И двете системи се появяват в гъби и кишечнополостни животни и се развиват заедно с тях, измествайки siRNA и механизма на "гола" интерференция на РНК. Тяхната роля в осигуряването на имунитет намалява, тъй като тази функция е поета от по-напреднали механизми на клетъчния имунитет, по-специално интерфероновата система. Тази система обаче е толкова чувствителна, че работи и върху самата siRNA: появата на малки двуверижни РНК в клетка на бозайник предизвиква „алармен сигнал“ (активира секрецията на интерферон и предизвиква експресията на интерферон-зависими гени, които блокира изцяло всички процеси на превод). В тази връзка механизмът на РНК интерференция при висши животни се медиира главно от микроРНК и piRNA, едноверижни молекули със специфична структура, които не се откриват от интерфероновата система.

Тъй като геномът става по-сложен, miRNAs и piRNAs стават все по-активни в регулирането на транскрипцията и транслацията. С течение на времето те се превърнаха в допълнителна, прецизна и фина система за регулиране на генома. За разлика от siRNAs, микроРНК и piRNAs (открити през 2001 г., виж каре 3) не се произвеждат от чужди двуверижни РНК молекули, а първоначално са кодирани в генома на гостоприемника.

Запознайте се с микроРНК

МикроРНК прекурсорът се транскрибира от двете вериги на геномна ДНК чрез РНК полимераза II, което води до междинна форма, pri-miRNA, която носи характеристиките на конвенционалната тРНК - m 7 G-cap и polyA опашка. Този предшественик образува бримка с две едноверижни „опашки“ и няколко несдвоени нуклеотида в центъра (фиг. 3). Такава бримка претърпява двуетапна обработка (фиг. 4): първо, ендонуклеазата на Drosha отрязва едноверижни РНК „опашки“ от фиби, след което отрязаната фиби (пред-микроРНК) се изнася в цитоплазмата, където разпознава се от Dicer, който прави още два разреза (изрязва се двуверижен участък) , обозначен с цвят на фиг. 3). В тази форма зрялата miRNA, подобно на siRNA, е включена в RISC комплекса.

Фигура 3. Структура на двуверижна микроРНК прекурсорна молекула.Основни характеристики: наличието на запазени последователности, които образуват фиби; наличието на комплементарно копие (микроРНК*) с два „допълнителни“ нуклеотида в 3′ края; специфична последователност (2-8 bp), която образува мястото за разпознаване на ендонуклеази. Самата микроРНК е подчертана в червено - това е, което Dicer изрязва.

Механизмът на действие на много микроРНК е подобен на този на siRNAs: къса (21-25 нуклеотида) едноверижна РНК в протеиновия комплекс RISC се свързва с висока специфичност към комплементарно място в 3'-нетранслираната област на целевата иРНК . Свързването води до разцепване на иРНК от Ago протеина. Въпреки това, активността на микроРНК (в сравнение с siRNAs) вече е по-диференцирана - ако комплементарността не е абсолютна, целевата тРНК може да не се разгради, а само обратимо блокирана (няма да има транслация). Може да се използва и същият RISC комплекс изкуствено въведени siRNA. Това обяснява защо siRNAs, направени по аналогия с протозоите, също са активни при бозайници.

Така можем да завършим илюстрацията на механизма на действие на РНК интерференцията при висши (двустранно симетрични) организми, като комбинираме в една фигура схемата на действие на микроРНК и биотехнологично въведените siРНК (фиг. 5).

Фигура 5. Обобщена схема на действието на изкуствени miRNAs и siRNAs(изкуствените siRNA се въвеждат в клетката с помощта на специализирани плазмиди - насочване към siRNA вектор).

Функции на miRNA

Физиологичните функции на miRNAs са изключително разнообразни; всъщност те действат като основни непротеинови регулатори на онтогенезата. miRNAs не отменят, а допълват "класическата" схема на генна регулация (индуктори, супресори, уплътняване на хроматина и т.н.). Освен това самият синтез на микроРНК се регулира по сложен начин (определени групи от микроРНК могат да бъдат включени от интерферони, интерлевкини, тумор некрозис фактор α (TNF-α) и много други цитокини). В резултат на това се появява многостепенна мрежа за създаване на „оркестър“ от хиляди гени, удивителна по своята сложност и гъвкавост, но това не е краят на въпроса.

microRNAs са по-„универсални“ от siRNAs: „отделните“ гени не трябва да бъдат 100% допълващи се – регулирането също се осъществява с частично взаимодействие. Днес една от най-горещите теми в молекулярната биология е търсенето на микроРНК, които действат като алтернативни регулатори на известни физиологични процеси. Например, miRNAs, участващи в регулирането на клетъчния цикъл и апоптозата в растенията, Drosophila и нематоди, вече са описани; при хората miRNAs регулират имунната система и развитието на хемопоетичните стволови клетки. Използването на технологии, базирани на биочипове (скрининг на микро-масиви), показа, че цели групи от малки РНК се включват и изключват на различни етапи от живота на клетката. За биологичните процеси са идентифицирани десетки специфични микроРНК, чието ниво на експресия при определени условия се променя хиляди пъти, подчертавайки изключителната контролируемост на тези процеси.

Доскоро се смяташе, че микроРНК само потискат – изцяло или частично – работата на гените. Наскоро обаче се оказа, че действието на miRNAs може коренно да се различава в зависимост от състоянието на клетката! В активно деляща се клетка, miRNA се свързва с комплементарна последователност в 3'-мястото на иРНК и инхибира протеиновия синтез (транслация). Въпреки това, в състояние на покой или стрес (например при отглеждане на лоша среда) едно и също събитие води до обратния ефект – увеличаване на синтеза на целевия протеин!

Еволюция на miRNA

Броят на разновидностите на микроРНК във висшите организми все още не е напълно установен - според някои данни той надвишава 1% от броя на гените, кодиращи протеини (при хората, например, те говорят за 700 микроРНК и този брой постоянно се увеличава нарастващ). микроРНК регулират активността на около 30% от всички гени (цели за много от тях все още не са известни) и има както повсеместни, така и тъканно-специфични молекули - например един такъв важен пул от микроРНК регулира узряването на кръвните стволови клетки .

Широкият профил на експресия в различни тъкани на различни организми и биологичното изобилие от miRNAs показват еволюционно древен произход. За първи път миРНК са открити в нематоди и дълго време се е смятало, че тези молекули се появяват само в гъби и кишечнополостни; по-късно обаче те са открити и в едноклетъчни водорасли. Интересно е, че тъй като организмите стават по-сложни, броят и хетерогенността на микроРНК пула също се увеличават. Това косвено показва, че сложността на тези организми се осигурява по-специално от функционирането на miRNAs. Възможната еволюция на miRNA е показана на Фигура 6.

Фигура 6. Разнообразие от miRNAs в различни организми.Колкото по-висока е организацията на организма, толкова повече miRNA се намират в него (числото в скоби). Видовете са маркирани в червено, в което единичен miRNA.

Може да се направи ясна еволюционна връзка между siRNA и microRNA въз основа на следните факти:

действието на двата вида е взаимозаменяемо и медиирано от хомоложни протеини;
siRNAs, въведени в клетките на бозайници, специфично „изключват“ необходимите гени (въпреки известно активиране на интерфероновата защита);
miRNAs се намират във все по-древни организми.

Тези и други данни предполагат произхода на двете системи от общ "прародител". Интересно е също да се отбележи, че „РНК“ имунитетът като независим предшественик на протеинови антитела потвърждава теорията за произхода на първите форми на живот, базирани на РНК, а не на протеини (припомнете си, че това е любимата теория на академик А. С. Спирин).

Колкото по-далеч, толкова по-объркващо. Играч #3 - piRNA

Докато имаше само двама „играчи“ на арената на молекулярната биология – siRNA и microRNA – основната „цел“ на интерференцията на РНК изглеждаше напълно ясна. Наистина: набор от хомоложни къси РНК и протеини в различни организми извършва сходни действия; тъй като организмите стават по-сложни, нараства и тяхната функционалност.

Въпреки това, в процеса на еволюция природата създава друга, еволюционно най-нова и високоспециализирана система, базирана на същия успешен принцип на РНК интерференция. Говорим за piRNA (piRNA, от РНК за взаимодействие с Piwi).

Колкото по-сложен е организиран геномът, толкова по-развит и адаптиран е организмът (или обратно? ;-). Въпреки това, увеличаването на сложността на генома има обратна страна: сложна генетична система става нестабилен. Това води до необходимостта от механизми, отговорни за поддържането на целостта на генома – в противен случай спонтанното „смесване“ на ДНК просто ще го деактивира. Мобилни генетични елементи ( SHP) - един от основните фактори за нестабилност на генома - са къси нестабилни региони, които могат да се транскрибират автономно и да мигрират през генома. Активирането на такива транспозируеми елементи води до множество счупвания на ДНК в хромозомите, които са изпълнени със смъртоносни последици.

Броят на MGE нараства нелинейно с размера на генома и тяхната активност трябва да се контролира. За да направят това, животните, които вече започват с кишечнополостни, използват същия феномен на РНК интерференция. Тази функция се изпълнява и от къси РНК, но не от тези, които вече са били обсъдени, а от третия им тип, piRNAs.

"Портрет" на piRNA

piRNA функции

Основната функция на piRNA е потискането на активността на MGE на ниво транскрипция и транслация. Смята се, че piRNAs са активни само по време на ембриогенезата, когато непредвидимото разместване на генома е особено опасно и може да доведе до смъртта на ембриона. Това е логично – когато имунната система все още не е работила, клетките на ембриона се нуждаят от някаква проста, но ефективна защита. От външни патогени ембрионът е надеждно защитен от плацентата (или яйчната черупка). Но освен това е необходима защита и от ендогенни (вътрешни) вируси, предимно MGE.

Тази роля на piRNA е потвърдена от опит - "нокаут" или мутации на гените Ago3, Piwi или Aub водят до сериозни нарушения в развитието (и рязко увеличаване на броя на мутациите в генома на такъв организъм), а също така причиняват безплодие поради нарушено развитие на зародишните клетки.

Разпределение и еволюция на piRNA

Първите piRNAs вече са открити в морски анемони и гъби. Растенията, очевидно, са тръгнали по друг път - в тях не са открити протеини на Piwi, а ролята на "муцуна" за транспозони се изпълнява от ендонуклеазата Ago4 и siRNA.

При висшите животни, включително хората, системата piRNA е много добре развита, но може да се намери само в ембрионалните клетки и в амниотичния ендотел. Защо разпределението на piRNA в тялото е толкова ограничено, остава да се види. Може да се предположи, че като всяко мощно оръжие, piRNA е полезна само при много специфични условия (по време на феталното развитие), а при възрастен организъм тяхната дейност ще причини повече вреда, отколкото полза. Все пак броят на piRNAs е с порядък по-голям от броя на известните протеини и неспецифичните ефекти на piRNA в зрелите клетки са трудни за прогнозиране.

Таблица 1. Свойства и на трите класа къси РНК

	siRNA	miRNA	piRNA
Разпространение	растения, дрозофила, C.elegans. Не се среща при гръбначни животни	еукариоти	Ембрионални клетки на животни (започвайки с кишечно-половите). Не в протозоите и растенията
Дължина	21-22 нуклеотида	19-25 нуклеотида	24-30 нуклеотида
структура	Двуверижни, 19 комплементарни нуклеотида и два несдвоени нуклеотида в 3' края	Едноверижна сложна структура	Едноверижна сложна структура. U в 5'-края, 2'- О-метилиран 3′ край
Обработка	Dicer зависим	Dicer зависим	Dicer независим
Ендонуклеази	преди 2	Преди 1, преди 2	Ago3, Piwi, Aub
Дейност	Разграждане на комплементарни иРНК, ацетилиране на геномна ДНК	Разграждане или инхибиране на транслацията на целевата иРНК	Разграждане на иРНК, кодираща MGE, регулиране на MGE транскрипцията
Биологична роля	Антивирусна имунна защита, потискане на активността на собствените гени	Регулиране на генната активност	Потискане на активността на MGE по време на ембриогенезата

Заключение

В заключение бих искал да дам таблица, илюстрираща еволюцията на протеиновия апарат, участващ в РНК интерференцията (фиг. 9). Вижда се, че протозоите имат най-развитата сиРНК система (протеинови семейства Ago, Dicer), а с усложняването на организмите акцентът се измества към по-специализирани системи - броят на протеиновите изоформи за микроРНК (Drosha, Pasha) и piRNA ( Piwi, Hen1) се увеличава. В същото време разнообразието от ензими, медииращи действието на siRNA, намалява.

Фигура 9. Разнообразие от протеини, участващи в РНК интерференцията(числата показват броя на протеините във всяка група). в синьоелементи, характерни за siRNA и microRNA са подчертани, и червен- протеин исвързани с piRNA.

Феноменът РНК интерференция започва да се използва от най-простите организми. Въз основа на този механизъм природата създаде прототип на имунната система и тъй като организмите стават по-сложни, РНК интерференцията се превръща в незаменим регулатор на активността на генома. Два различни механизма плюс три вида къси РНК ( см.раздел. 1) - в резултат виждаме хиляди фини регулатори на различни метаболитни и генетични пътища. Тази поразителна картина илюстрира гъвкавостта и еволюционната адаптация на молекулярните биологични системи. Кратките РНК отново доказват, че вътре в клетката няма „малки неща“ – има само малки молекули, пълното значение на чиято роля едва започваме да разбираме.

(Вярно, такава фантастична сложност говори по-скоро, че еволюцията е „сляпа” и действа без предварително одобрен „генерален план”»;

Андрю Гримсън, Манси Шривастава, Брайони Фейи, Бен Дж. Уудкрофт, Х. Розария Чианг и др. др. (2008). Ранен произход и еволюция на микроРНК и взаимодействащи с Piwi РНК при животни. природата. 455 , 1193-1197;

A. A. Aravin, G. J. Hannon, J. Brennecke. (2007). Пътят на Piwi-piRNA осигурява адаптивна защита в надпреварата във въоръжаването на Transposon. наука. 318 , 761-764;

Метафората, лежаща в основата на името на феномена РНК интерференция, се отнася до експеримента с петуния, когато гените за синтетаза на розови и лилави пигменти, изкуствено въведени в растението, не увеличават интензитета на цвета, а, напротив, го намаляват. По същия начин, при "обикновена" интерференция, наслагването на две вълни може да доведе до взаимно "угасване".

В жива клетка потокът от информация между ядрото и цитоплазмата никога не пресъхва, но разбирането на всичките й „обратки“ и дешифрирането на информацията, кодирана в нея, е наистина титанична задача. Един от най-важните пробиви в биологията на миналия век може да се счита за откриването на информационни (или шаблонни) РНК молекули (мРНК или иРНК), които служат като посредници, които пренасят информационни „съобщения“ от ядрото (от хромозомите) до цитоплазма. Решаващата роля на РНК в протеиновия синтез е предвидена още през 1939 г. в работата на Торбьорн Касперсон, Жан Браше и Джак Шулц, а през 1971 г. Джордж Марбе стартира синтеза на хемоглобин в ооцитите на жаби чрез инжектиране на първата изолирана заешка пратена РНК, кодираща тази РНК. протеин.

През 1956-57 г. в Съветския съюз А. Н. Белозерски и А. С. Спирин независимо доказаха съществуването на иРНК и също така установиха, че по-голямата част от РНК в клетката в никакъв случай не е матрична, а рибозомна РНК (рРНК). Рибозомната РНК - вторият "основен" тип клетъчна РНК - образува "скелета" и функционалния център на рибозомите във всички организми; именно рРНК (а не протеините) регулира основните етапи на протеиновия синтез. В същото време беше описан и проучен третият „основен“ тип РНК, трансферна РНК (tRNA), която в комбинация с другите два, mRNA и rRNA, образуват един протеин-синтезиращ комплекс. Според доста популярната хипотеза за "света на РНК", именно тази нуклеинова киселина лежи в началото на живота на Земята.

Поради факта, че РНК е много по-хидрофилна от ДНК (поради заместването на дезоксирибоза с рибоза), тя е по-лабилна и може да се движи относително свободно в клетката и следователно да доставя краткотрайни реплики на генетична информация (иРНК) на мястото, където се синтезира протеин. Въпреки това си струва да се отбележи „неудобството“, свързано с това - РНК е много нестабилна. Съхранява се много по-лошо от ДНК (дори вътре в клетката) и се разгражда при най-малката промяна в условията (температура, pH). В допълнение към тяхната "собствена" нестабилност, голям принос принадлежи на рибонуклеазите (или РНКазите) - клас ензими, разцепващи РНК, много стабилни и "вездесъщи" - дори кожата на ръцете на експериментатора съдържа достатъчно от тези ензими, за да се зачеркне целия експеримент. Поради това работата с РНК е много по-трудна, отколкото с протеини или ДНК – последните обикновено могат да се съхраняват стотици хиляди години с малко или никакво увреждане.

Фантастична точност по време на работа, тридестилат, стерилни ръкавици, лабораторни съдове за еднократна употреба - всичко това е необходимо, за да се предотврати разграждането на РНК, но спазването на такива стандарти не винаги е било възможно. Следователно дълго време късите „фрагменти“ от РНК, които неизбежно замърсяват разтворите, просто бяха игнорирани. С течение на времето обаче стана ясно, че въпреки всички усилия за поддържане на стерилността на работната зона, „отломките“ естествено продължават да се откриват и след това се оказва, че винаги има хиляди къси двуверижни РНК в цитоплазмата които изпълняват доста специфични функции и са абсолютно необходими за нормалното развитие.клетки и организми.

Принцип на РНК интерференция

Днес изучаването на малки регулаторни РНК е една от най-бързо развиващите се области на молекулярната биология. Установено е, че всички къси РНК изпълняват своите функции въз основа на явление, наречено РНК интерференция (същността на това явление е потискането на генната експресия на етапа на транскрипция или транслация с активното участие на малки РНК молекули). Много схематично механизмът на РНК интерференцията е показан на фиг. 1:

Ориз. 1. Основи на RNAi
Двуверижните РНК молекули (dsRNA) не са характерни за нормалните клетки, но са съществена стъпка в жизнения цикъл на много вируси. Специален протеин на Dicer, след като намери dsRNA в клетката, я „нарязва“ на малки фрагменти. Антисенс веригата на такъв фрагмент, който вече може да се нарече къса интерферираща РНК (siRNA, от siRNA - малка интерферентна РНК), е свързана с протеинов комплекс, наречен RISC (РНК-индуциран заглушаващ комплекс), централният елемент на който е ендонуклеаза от семейство Аргонавти. Свързването с siRNA активира RISC и задейства търсене на ДНК и РНК молекули в клетката, които са комплементарни на "шаблонната" siRNA. Съдбата на такива молекули е да бъдат унищожени или инактивирани от RISC комплекса.

Обобщавайки, кратките „отрязвания“ на чужда (включително умишлено въведена) двуверижна РНК служат като „шаблон“ за широкомащабно търсене и унищожаване на комплементарни иРНК (и това е еквивалентно на потискане на експресията на съответния ген) , не само в една клетка, но и в съседна. За много организми – протозои, мекотели, червеи, насекоми, растения – това явление е един от основните начини за имунна защита срещу инфекции.

През 2006 г. Андрю Файър и Крейг Мело получиха Нобелова награда за физиология и медицина „за откриването на феномена РНК интерференция – механизма на заглушаване на гените с участието на dsRNA“. Въпреки че самият феномен на РНК интерференцията е описан много преди (в началото на 80-те години на миналия век), работата на Fire и Mello очертава регулаторния механизъм на малките РНК и очертава неизвестната досега област на молекулярните изследвания. Ето основните резултати от тяхната работа:

При РНК интерференцията се разцепва иРНК (и никаква друга);
Двуверижната РНК действа (предизвиква разцепване) много по-ефективно от едноверижната. Тези две наблюдения предсказват съществуването на специализирана система, медиираща действието на dsRNA;
dsRNA, комплементарна на участък от зряла иРНК, причинява разцепване на последната. Това показва цитоплазмената локализация на процеса и наличието на специфична ендонуклеаза;
Малко количество dsRNA (няколко молекули на клетка) е достатъчно за пълно „изключване“ на целевия ген, което показва наличието на каскаден механизъм на катализа и/или амплификация.

Тези резултати положиха основата на цяла област на съвременната молекулярна биология - РНК интерференцията - и определиха вектора на работа на много изследователски групи по света за повече от дузина години. Към днешна дата са открити три големи групи от малки РНК, които играят в молекулярното поле за „екипа за интерференция на РНК“. Нека ги опознаем по-подробно.

Играч #1 - Кратки интерфериращи РНК

Специфичността на РНК интерференцията се определя от къси интерфериращи РНК (siRNAs) - малки двуверижни РНК молекули с добре дефинирана структура (виж фиг. 2).

siRNAs са еволюционно най-ранните и са най-широко разпространени в растенията, едноклетъчните организми и безгръбначните. При нормалните гръбначни животни siRNAs практически не се срещат, тъй като те са били изместени от по-късни „модели“ на къси РНК (вижте по-долу).

siRNAs - "шаблони" за търсене в цитоплазмата и унищожаване на mRNA молекули - имат дължина от 20-25 нуклеотида и "специален знак": 2 несдвоени нуклеотида в 3'-края и фосфорилиран 5'-края. Антисенс siRNA е способна (не сама по себе си, разбира се, а с помощта на RISC комплекс) да разпознае иРНК и конкретно да предизвика нейното разграждане: разрязването на целевата иРНК винаги се случва точно на мястото, комплементарно на 10 и 11 нуклеотида на антисенс сиРНК веригата.

Ориз. 2. Механизъм на “интерференция” между иРНК и siRNA
"Интерфериращи" къси РНК молекули могат както да влязат в клетката отвън, така и да "изрежат" вече на място от по-дълга двуверижна РНК. Основният протеин, необходим за "разрязване" на dsRNA, е ендонуклеазата на Dicer. „Изключването“ на гена по механизма на интерференция се извършва от siRNA заедно с протеиновия комплекс RISC, който се състои от три протеина - Ago2 ендонуклеаза и два спомагателни протеина PACT и TRBP. По-късно беше установено, че Dicer и RISC комплексите могат да използват не само dsRNA като семе, но и едноверижна РНК, образуваща двуверижна фиби, както и готова siRNA (последната заобикаля етапа на „разрязване“ и незабавно се свързва с RISC).

Функциите на siRNAs в клетките на безгръбначни са доста разнообразни. Първата и основна е имунната защита. „Традиционната” имунна система (лимфоцити + левкоцити + макрофаги) присъства само в сложните многоклетъчни организми. При едноклетъчните организми, безгръбначните и растенията (които или нямат такава система, или е в зародиш) имунната защита се изгражда на базата на РНК интерференция. Имунитетът, базиран на РНК интерференция, не се нуждае от сложни органи за "обучение" на предшествениците на имунните клетки (далак, тимус); в същото време разнообразието от теоретично възможни къси РНК последователности (421 варианта) е свързано с броя на възможните протеинови антитела при висши животни. В допълнение, siRNAs се синтезират на базата на „враждебната“ РНК, която е заразила клетката, което означава, че за разлика от антителата, те незабавно се „изострят“ за специфичен вид инфекция. И въпреки че защитата, базирана на РНК интерференция, не работи извън клетката (поне все още няма такива данни), тя осигурява вътреклетъчен имунитет повече от задоволително.

На първо място, siRNA създава антивирусен имунитет чрез унищожаване на иРНК или геномна РНК на инфекциозни организми (например, така е открита siRNA в растенията). Въвеждането на вирусна РНК предизвиква мощно усилване на специфични siRNAs, базирани на семенна молекула - самата вирусна РНК. В допълнение, siRNAs потискат експресията на различни мобилни генетични елементи (MGEs), което означава, че те също така осигуряват защита срещу ендогенни „инфекции“. Мутациите в гените на RISC комплекса често водят до повишена нестабилност на генома поради висока MGE активност; siRNA може да бъде ограничител на експресията на собствените си гени, задействайки се в отговор на тяхната свръхекспресия. Регулирането на работата на гените може да се случи не само на ниво транслация, но и по време на транскрипция - чрез метилиране на гени в H3 хистона.

В съвременната експериментална биология значението на РНК интерференцията и късите РНК не може да бъде надценено. Разработена е технологията за "изключване" (или събаряне) на отделни гени in vitro (върху клетъчни култури) и in vivo (върху ембриони), която вече се превърна в де факто стандарт в изследването на всеки ген. Понякога, дори за да установят ролята на отделните гени в някакъв процес, те систематично „изключват“ всички гени на свой ред.

Фармацевтите също се интересуват от възможността за използване на siRNA, тъй като способността за директно регулиране на работата на отделните гени обещава нечувани перспективи при лечението на множество заболявания. Малкият размер и високата специфичност на действие обещават висока ефикасност и ниска токсичност на лекарствата, базирани на siRNA; обаче все още не е възможно да се реши проблемът с доставянето на siRNA до болните клетки в тялото поради крехкостта и крехкостта на тези молекули. И въпреки че сега десетки екипи се опитват да намерят начин да насочат тези „магически куршуми“ точно към целта (вътре в болните органи), те все още не са постигнали видим успех. Освен това има и други трудности. Например, в случай на антивирусна терапия, високата селективност на действието на siRNA може да бъде лоша услуга - тъй като вирусите бързо мутират, модифицираният щам много бързо ще загуби чувствителност към siRNA, избрана в началото на терапията: известно е, че заместването само на един нуклеотид в siRNA води до значително намаляване на интерференционния ефект.

В този момент си струва да припомним още веднъж, че siRNAs са открити само в растения, безгръбначни и едноклетъчни организми; Въпреки че хомолози на протеини за РНК интерференция (Dicer, RISC комплекс) също присъстват във висши животни, siRNAs не са открити чрез конвенционални методи. Каква изненада беше, когато изкуствено въведените синтетични аналози на siRNA предизвикаха силен специфичен дозозависим ефект в клетъчни култури на бозайници! Това означаваше, че в клетките на гръбначните животни, РНК интерференцията не е заменена от по-сложни имунни системи, а еволюира заедно с организмите, превръщайки се в нещо по-„напреднало“. Следователно при бозайниците беше необходимо да се търсят не точни аналози на siRNA, а техните еволюционни наследници.

Играч #2 - miRNA

Всъщност, въз основа на еволюционно доста древния механизъм на РНК интерференция, по-развитите организми са разработили две специализирани системи за контрол на работата на гените, като всяка използва своя собствена група от малки РНК - микроРНК (микроРНК) и пиРНК (piRNA, Piwi- взаимодействаща РНК). И двете системи се появяват в гъби и кишечнополостни животни и се развиват заедно с тях, измествайки siRNA и механизма на "гола" интерференция на РНК. Тяхната роля в осигуряването на имунитет намалява, тъй като тази функция е поета от по-напреднали механизми на клетъчния имунитет, по-специално интерфероновата система. Тази система обаче е толкова чувствителна, че работи и върху самата siRNA: появата на малки двуверижни РНК в клетка на бозайник предизвиква „алармен сигнал“ (активира секрецията на интерферон и предизвиква експресията на интерферон-зависими гени, които блокира изцяло всички процеси на превод). В тази връзка механизмът на РНК интерференция при висши животни се медиира главно от микроРНК и piRNA, едноверижни молекули със специфична структура, които не се откриват от интерфероновата система.

Тъй като геномът става по-сложен, miRNAs и piRNAs стават все по-активни в регулирането на транскрипцията и транслацията. С течение на времето те се превърнаха в допълнителна, прецизна и фина система за регулиране на генома. За разлика от siRNAs, микроРНК и piRNAs (открити през 2001 г., виж Фиг. 3, A-B) не се произвеждат от чужди двуверижни РНК молекули, а първоначално са кодирани в генома на организма гостоприемник.

МиРНК прекурсорът се транскрибира от двете вериги на геномна ДНК чрез РНК полимераза II, което води до междинна форма, pri-miRNA, която носи характеристиките на конвенционалната иРНК, m7G шапката и polyA опашката. Този прекурсор образува бримка с две едноверижни „опашки“ и няколко несдвоени нуклеотида в центъра (фиг. 3А). Такъв цикъл се подлага на двуетапна обработка (фиг. B): първо, Drosha ендонуклеазата отрязва едноверижни РНК „опашки“ от фиби, след което отрязаната фиби (пред-микроРНК) се изнася в цитоплазмата, където се разпознат от Dicer, което прави още два разфасовки (изрязва се двуверижен регион). , обозначен с цвят на фиг. 3А). В тази форма зрялата miRNA, подобно на siRNA, е включена в RISC комплекса.

Механизмът на действие на много miRNAs е подобен на този на siRNAs: къса (21-25 нуклеотида) едноверижна РНК в протеиновия комплекс RISC се свързва с висока специфичност към комплементарно място в 3'-нетранслираната област на целевата иРНК . Свързването води до разцепване на иРНК от Ago протеина. Въпреки това, активността на микроРНК (в сравнение с siRNAs) вече е по-диференцирана: ако комплементарността не е абсолютна, целевата иРНК може да не бъде разградена, а само обратимо блокирана (няма да има транслация). Същият RISC комплекс може да използва и изкуствено въведени siRNA. Това обяснява защо siRNAs, направени по аналогия с протозоите, също са активни при бозайници.

По този начин можем да допълним илюстрацията на механизма на действие на РНК интерференцията при по-висши (двустранно симетрични) организми, като комбинираме в една фигура схемата на действие на miRNAs и биотехнологично въведените siRNAs (фиг. 3C).

Ориз. 3А: Структура на двуверижна молекула прекурсор на miRNA
Основни характеристики: наличието на запазени последователности, които образуват фиби; наличието на комплементарно копие (микроРНК*) с два „допълнителни“ нуклеотида в 3’-края; специфична последователност (2-8 bp), която образува мястото за разпознаване на ендонуклеази. Самата miRNA е подчертана в червено - това е, което Dicer изрязва.

Ориз. 3B: Общ механизъм на обработка на miRNA и реализация на нейната активност

Ориз. 3B: Обобщена схема на действието на изкуствени miRNAs и siRNAs
Изкуствените siRNA се въвеждат в клетката с помощта на специализирани плазмиди (насочен към siRNA вектор).

Функции на miRNA

miRNAs са по-„универсални“ от siRNAs: гените на „отдел“ не трябва да бъдат 100% допълващи се – регулирането също се извършва с частично взаимодействие. Днес една от най-горещите теми в молекулярната биология е търсенето на микроРНК, които действат като алтернативни регулатори на известни физиологични процеси. Например, miRNAs, участващи в регулирането на клетъчния цикъл и апоптозата в растенията, Drosophila и нематоди, вече са описани; при хората miRNAs регулират имунната система и развитието на хемопоетичните стволови клетки. Използването на технологии, базирани на биочипове (скрининг на микро-масиви), показа, че цели групи от малки РНК се включват и изключват на различни етапи от живота на клетката. За биологичните процеси са идентифицирани десетки специфични микроРНК, чието ниво на експресия при определени условия се променя хиляди пъти, подчертавайки изключителната контролируемост на тези процеси.

Доскоро се смяташе, че miRNAs само потискат - изцяло или частично - работата на гените. Наскоро обаче се оказа, че действието на miRNAs може коренно да се различава в зависимост от състоянието на клетката! В активно деляща се клетка, miRNA се свързва с комплементарна последователност в 3'-мястото на иРНК и инхибира протеиновия синтез (транслация). Въпреки това, в състояние на покой или стрес (например при отглеждане на лоша среда) едно и също събитие води до обратния ефект – увеличаване на синтеза на целевия протеин!

Еволюция на miRNA

Ориз. 4. Разнообразие от miRNAs в различни организми
Колкото по-висока е организацията на организма, толкова повече miRNA се намират в него (числото в скоби). Видовете с единични miRNAs са подчертани в червено. Според .

Може да се направи ясна еволюционна връзка между siRNA и microRNA въз основа на следните факти:

действието на двата вида е взаимозаменяемо и медиирано от хомоложни протеини;
siRNAs, въведени в клетките на бозайници, специфично „изключват“ необходимите гени (въпреки известно активиране на интерфероновата защита);
miRNAs се намират във все по-древни организми.

Докато имаше само двама „играчи“ на арената на молекулярната биология – siRNA и miRNA – основната „цел“ на интерференцията на РНК изглеждаше напълно ясна. Наистина: набор от хомоложни къси РНК и протеини в различни организми извършва сходни действия; тъй като организмите стават по-сложни, нараства и тяхната функционалност.

Колкото по-сложен е организиран геномът, толкова по-развит и адаптиран е организмът (или обратно? ;-). Увеличаването на сложността на генома обаче има обратна страна: сложната генетична система става нестабилна. Това води до необходимостта от механизми, отговорни за поддържането на целостта на генома – в противен случай спонтанното „смесване“ на ДНК просто ще го деактивира. Мобилните генетични елементи (MGE), един от основните фактори за нестабилност на генома, са къси, нестабилни региони, които могат автономно да транскрибират и мигрират в целия геном. Активирането на такива транспозируеми елементи води до множество счупвания на ДНК в хромозомите, които са изпълнени със смъртоносни последици.

"Портрет" на piRNA

piRNAs са къси молекули с дължина 24-30 нуклеотида, кодирани в центромерните и теломерните области на хромозомата. Последователностите на много от тях са комплементарни към известните мобилни генетични елементи, но има много други piRNA, които съвпадат с региони на работещи гени или с геномни фрагменти, чиито функции са неизвестни.

piRNAs (както и микроРНК) са кодирани в двете вериги на геномната ДНК; те са много променливи и разнообразни (до 500 000 (!) вида в един организъм). За разлика от siRNAs и microRNAs, те се образуват от единична верига с характерна особеност - урацил (U) в 5' края и метилиран 3' край. Има и други разлики:

За разлика от siRNAs и miRNAs, те не изискват обработка на Dicer;
piRNA гените са активни само в зародишните клетки (по време на ембриогенезата) и околните ендотелни клетки;
Протеиновият състав на piRNA системата е различен - това са ендонуклеазите от клас Piwi (Piwi и Aub) и отделна разновидност на Argonaute - Ago3.

Процесът и активността на piRNAs все още са слабо разбрани, но вече е ясно, че механизмът на действие е напълно различен от другите къси РНК – днес е предложен пинг-понг модел на тяхната работа (фиг. 5 A, B).

Пинг-понг механизъм на биогенезата на piRNA

Ориз. 5A: Цитоплазмена част от обработката на piRNA
Биогенезата и активността на PiRNA се медиират от семейството на ендонуклеазата на Piwi (Ago3, Aub, Piwi). piRNA активността се медиира от двете едноверижни piRNA молекули, сенс и антисенс, всяка от които се свързва със специфична Piwi ендонуклеаза. piRNA разпознава комплементарния регион на транспозонната иРНК (синя верига) и го изрязва. Това не само инактивира транспозона, но също така създава нова piRNA (свързана с Ago3 чрез Hen1 метилаза метилиране на 3' края). Такава piRNA от своя страна разпознава иРНК с транскрипти на клъстер прекурсор на piRNA (червена верига) - по този начин цикълът се затваря и желаната piRNA се произвежда отново.

Ориз. 5B: piRNA в ядрото
В допълнение към Aub ендонуклеазата, Piwi ендонуклеазата може също да свърже антисенс piRNA. След свързването комплексът мигрира към ядрото, където причинява разграждане на комплементарни транскрипти и пренареждане на хроматина, причинявайки потискане на активността на транспозона.

piRNA функции

Тази роля на piRNA е потвърдена от опит – „нокаут“ или мутации на гените Ago3, Piwi или Aub водят до сериозни нарушения в развитието (и рязко увеличаване на броя на мутациите в генома на такъв организъм), а също и причиняват безплодие поради нарушено развитие на зародишните клетки.

Разпределение и еволюция на piRNA

Пивотна маса. Свойства и на трите класа къси РНК

	siRNA	miRNA	piRNA
Разпространение	растения, дрозофила, C.elegans. Не се среща при гръбначни животни	еукариоти	Ембрионални клетки на животни (започвайки с кишечно-половите). Не в протозоите и растенията
Дължина	21-22 нуклеотида	19-25 нуклеотида	24-30 нуклеотида
структура	Двуверижни, 19 комплементарни нуклеотида и два несдвоени нуклеотида в 3' края	Едноверижна сложна структура	Едноверижна сложна структура. U в 5'-края, 2'- О-метилиран 3' край
Обработка	Dicer зависим	Dicer зависим	Dicer независим
Ендонуклеази	преди 2	Преди 1, преди 2	Ago3, Piwi, Aub
Дейност	Разграждане на комплементарни иРНК, ацетилиране на геномна ДНК	Разграждане или инхибиране на транслацията на целевата иРНК	Разграждане на иРНК, кодираща MGE, регулиране на MGE транскрипцията
Биологична роля	Антивирусна имунна защита, потискане на активността на собствените гени	Регулиране на генната активност	Потискане на активността на MGE по време на ембриогенезата

Заключение

В заключение бих искал да дам таблица, илюстрираща еволюцията на протеиновия апарат, участващ в РНК интерференцията (фиг. 6). Вижда се, че протозоите имат най-развитата система siRNA (протеинови семейства Ago, Dicer), а с усложняването на организмите акцентът се измества към по-специализирани системи: броят на протеиновите изоформи за микроРНК (Drosha, Pasha) и piRNA ( Piwi, Hen1) се увеличава. В същото време разнообразието от ензими, медииращи действието на siRNA, намалява.

Ориз. 6. Разнообразие от протеини, участващи в РНК интерференцията и
Числата показват броя на протеините във всяка група. Елементите, характерни за siRNA и microRNA, са подчертани в синьо, а протеините, свързани с piRNA, са подчертани в червено. Според .

Феноменът РНК интерференция започва да се използва от най-простите организми. Въз основа на този механизъм природата създаде прототип на имунната система и тъй като организмите стават по-сложни, РНК интерференцията се превръща в незаменим регулатор на активността на генома. Два различни механизма плюс три вида къса РНК (вижте обобщената таблица) - в резултат виждаме хиляди фини регулатори на различни метаболитни и генетични пътища. Тази поразителна картина илюстрира гъвкавостта и еволюционната адаптация на молекулярните биологични системи. Кратките РНК отново доказват, че вътре в клетката няма „малки неща“ – има само малки молекули, пълното значение на чиято роля едва започваме да разбираме.

Вярно е, че такава фантастична сложност говори по-скоро за това, че еволюцията е „сляпа“ и действа без предварително одобрен „генерален план“.

литература

Gurdon J.B., Lane C.D., Woodland H.R., Marbaix G. (1971). Използване на жабешки яйца и ооцити за изследване на информационната РНК и нейния превод в живи клетки. Nature 233, 177-182;
Спирин А. С. (2001). Биосинтеза на протеини, светът на РНК и произходът на живота. Бюлетин на Руската академия на науките 71, 320-328;
Елементи: „Пълни митохондриални геноми на изчезнали животни вече могат да бъдат извлечени от косата“;
Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. (1998). Мощна и специфична генетична интерференция от двуверижна РНК в Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-311;
Биомолекула: "МикроРНК, открита за първи път в едноклетъчен организъм";
Covey S., Al-Kaff N., Lángara A., Turner D. (1997). Растенията се борят с инфекцията чрез генно заглушаване. Nature 385, 781-782;
Биомолекула: „Молекулярна двойна сделка: човешките гени работят за грипния вирус“;
Рен Б. (2010). Транскрипция: Подобрителите правят некодираща РНК. Nature 465, 173-174;
Таганов К.Д., Болдин М.П., Чанг К.Д., Балтимор Д. (2006). NF-κB-зависима индукция на miR-146 микроРНК, инхибитор, насочен към сигнални протеини на вродени имунни отговори. Proc. Natl. Акад. sci. САЩ. 103, 12481-12486;
O'Connell R.M., Rao D.S., Chaudhuri A.A., Boldin M.P., Taganov K.D., Nicoll J., Paquette R.L., Baltimore D. (2008). Продължителната експресия на микроРНК-155 в хематопоетични стволови клетки причинява миелопролиферативно разстройство. J. Exp. Мед. 205, 585-594;
Биомолекула: "микроРНК - колкото по-навътре в гората, толкова повече дърва за огрев";
Елементи: „Усложнението на организма при древните животни е свързано с появата на нови регулаторни молекули“;
Grimson A., Srivastava M., Fahey B., Woodcroft B.J., Chiang H.R., King N., Degnan B.M., Rokhsar D.S., Bartel D.P. (2008 г.). Ранен произход и еволюция на микроРНК и взаимодействащи с Piwi РНК при животни. Nature 455, 1193-1197.
Aravin A., Hannon G, Brennecke J. (2007). Пътят на Piwi-piRNA осигурява адаптивна защита в надпреварата във въоръжаването на Transposon. Наука 318, 761–764;
Биомолекула: "

А.М. Дейчман, С. В. Зиновиев, А. Ю. Баришников

ГЕННА ЕКСПРЕСИЯ И МАЛКА РНК В ОНКОЛОГИЯТА

ГУ РОНЦ им. N.N.Blokhina RAMS, Москва

РЕЗЮМЕ

Статията представя ролята на малките РНК, които контролират повечето от жизнените функции на клетката и тялото, и тяхната възможна връзка, в частност, с онкогенезата и други (включително хипотетични) вътреклетъчни механизми на геномна експресия.

Ключови думиКлючови думи: малки РНК, РНК интерференция (RNAi), двуверижна РНК (lncRNA), РНК редактиране, онкогенеза.

А.М. Дайхман, С.В.Зиновиев, А.Ю.Баришников.

ГЕННАТА ЕКСПРЕСИЯ И МАЛКИ РНК В ОНКОЛОГИЯТА

Н.Н. Руски изследователски център за рак на Блохин РАМН, Москваow

РЕЗЮМЕ

В статията е представена ролята на малките РНК, контролиращи повечето жизнени функции на клетката и организма и възможната им връзка по-специално с онкогенезата и други (включително хипотетични) вътреклетъчни механизми на геномна експресия.

ключови думи: Малки РНК, интерферентни РНК (RNAi), двуверижни РНК (dsRNAs), редактиране на РНК, туморогенеза.

Въведение

Експресията на отделни гени и цели еукариотни геноми, включително обработка, различни видове транскрипция, сплайсинг, пренареждания, редактиране на РНК, рекомбинации, транслация, РНК интерференция, се регулира от някои протеини (продукти на регулаторни, структурни, хомеотични гени, транскрипционни фактори) , мобилни елементи, РНК и ефектори с ниско молекулно тегло. Обработващите РНК включват рРНК, тРНК, иРНК, някои регулаторни РНК и малки РНК.

Към днешна дата е известно, че малките РНК не кодират протеин, често наброяват стотици на геном и участват в регулирането на експресията на различни еукариотни гени (соматични, имунни, зародишни, стволови клетки). Под контрол са процесите на диференциация (хемопоеза, ангиогенеза, адипогенеза, миогенеза, неврогенеза), морфогенеза (включително ембрионални етапи, развитие/растеж, физиологична регулация), пролиферация, апоптоза, канцерогенеза, мутагенеза, имуногенеза, удължаване на стареенето епигенетично заглушаване; са отбелязани случаи на метаболитна регулация (напр. гликосфинголипиди). По-широк клас некодиращи РНК от 20-300/500 нуклеотида и техните RNP са открити не само в ядрото/нуклеола/цитоплазмата, но също и в ДНК-съдържащи клетъчни органели (животински митохондрии; в растения, микро-РНК и последователности на малка РНК).

За управлението и регулирането на V.N. процеси е важно: 1. че малките естествени/изкуствени РНК (малки РНК, тРНК и др.) и техните комплекси с протеини (RNPs) са способни на трансмембранен клетъчен и митохондриален транспорт; 2. че след колапса на митохондриите част от съдържанието им, РНК и RNP, може да попадне в цитоплазмата и ядрото. Изброените свойства на малките РНК (RNP), чиято функционално значима роля само нараства в процеса на изследване, очевидно имат връзка с фактора на бдителност по отношение на рак и други генетични заболявания. В същото време стана ясно голямото значение на епигеномните модификации на хроматина в развитието на тумори. Ще разгледаме само много ограничен брой случаи от много подобни.

Малка РНК

Механизмът на действие на малките РНК е способността им да се свързват почти комплементарно с 3'-нетранслирани региони (3'-UTRs) на целевите иРНК (които понякога съдържат ДНК/РНК транспониращи MIR/LINE-2 елементи, както и запазени Alu повторения ) и предизвикват РНК интерференция (RNAi=RNAi; особено при антивирусен отговор). Усложнението обаче е, че освен клетъчни, има и вирусно кодирани малки РНК (херпес, SV40 и др.; EBV например съдържа 23, а KSHV - 12 miRNAs), взаимодействащи с транскриптите на както вируса, така и гостоприемника. Само повече от 5000 клетъчни/вирусни miRNA са известни в 58 вида. RNAi инициира или разграждане (с участието на RISC комплекса, RNA-индуциран комплекс за заглушаване) при нуклеазно уязвими фрагменти от непрекъснати спирали на lncRNA (двуверижна RNA mRNA и др.), или частично обратимо инхибиране на прекъснато навита lncRNA на тРНК мишени. Зрелите малки РНК (~15-28 нуклеотида) се образуват в цитоплазмата от техните предшественици с различна дължина (десетки и стотици нуклеотиди), които се обработват в ядрото. В допълнение, малките РНК участват в образуването на заглушаващата структура на хроматина, регулирането на транскрипцията на отделни гени, потискането на експресията на транспозон и поддържането на функционалната структура на разширените участъци на хетерохроматина.

Има няколко основни типа малки РНК. МикроРНК (miRNAs) и малките интерфериращи РНК (siRNAs) са най-добре проучените. В допълнение, сред малките РНК се изследват следните: piRNAs, активни в клетките на зародишната линия; малки интерфериращи РНК, свързани с ендогенни ретротранспозони и повтарящи се елементи (с локална/глобална хетерохроматизация - започвайки от ранните етапи на ембриогенезата; поддържане на нивото на теломерите), Drosophia rasiRNAs; често кодирани от интрони на протеинови гени и функционално важни при транслация, транскрипция, сплайсинг (де-/метилиране, псевдоуридилиране на нуклеинови киселини) малки ядрени (snRNAs) и нуклеоларни (snoRNAs) РНК; комплементарни към ДНК-свързващите NRSE-(Neuron Restrictive Silenser Element) мотиви, малки модулиращи РНК, smRNAs, с малко известни функции; трансактивиращи растителни малки интерфериращи РНК, tasiRNAs; къси фиби РНК, shRNAs, осигуряващи дългосрочно RNAi (постоянно генно заглушаване) на дълги lncRNA структури в антивирусния отговор при животни.

Малките РНК (miRNAs, siRNAs и др.) взаимодействат с новосинтезирани транскрипти на ядрото/цитоплазмата (регулиране на сплайсинг, транслация на иРНК; метилиране/псевдоуридилиране на рРНК и т.н.) и хроматин (с временно локална и епигенетично наследена хетерохроматин на divichromatin зародишни клетки). Хетерохроматинизацията, по-специално, е придружена от де-/метилиране на ДНК, както и метилиране, ацетилиране, фосфорилиране и убиквитиниране на хистони (модификация на "хистоновия код").

МиРНК на нематодата Caenorhabditis elegans (lin-4), техните свойства и гени са първите, които са открити и изследвани сред малки РНК, а малко по-късно и miRNAs на растението Arabidopsis thaliana. Понастоящем те се свързват с многоклетъчни организми, въпреки че са показани в едноклетъчните водорасли Chlamydomonas reinhardtii и RNAi-подобни заглушаващи пътища, във връзка с антивирусна/подобна защита, включваща т.нар. psiRNAs се обсъждат за прокариоти. Геномите на много еукариоти (включително дрозофила и хора) съдържат няколкостотин гени на miRNAs. Тези гени, специфични за етап/тъкан (както и съответните им целеви региони на иРНК) често са силно хомоложни във филогенетично отдалечени видове, но някои от тях са специфични за линията. miRNAs се съдържат в екзони (протеин-кодиращи, РНК гени), интрони (най-често пре-мРНК), интергенни спейсери (включително повторения), имат дължина до 70-120 нуклеотида (или повече) и образуват бримка/стебло. структури. За определяне на техните гени се използват не само биохимични и генетични, но и компютърни подходи.

Най-характерната дължина на "работната област" на зрелите miRNAs е 21-22 нуклеотида. Това са може би най-многобройните от некодиращите протеини гени. Те могат да бъдат подредени като отделни копия (по-често) или клъстери, съдържащи много подобни или различни гени на miRNA, транскрибирани (не рядко от автономни промотори) като по-дълъг прекурсор, обработен на няколко етапа до отделни miRNAs. Предполага се, че съществува регулаторна miRNA мрежа, която контролира много фундаментални биологични процеси (включително онкогенеза/метастази); вероятно поне 30% от човешките експресирани гени се регулират от miRNAs.

Този процес включва lncRNA-специфични RNase-III-подобни ензими Drosha (ядрена рибонуклеаза; инициира обработката на интронни pre-miRNAs след сплайсинг на основния транскрипт) и Dicer, който функционира в цитоплазмата и съответно разцепва/разгражда щипката предварително miRNAs (за зрели miRNAs). ) и по-късно хибридни miRNAs/mRNA структури. Малки РНК, заедно с няколко протеина (включително h.p. РНКази, протеини от семейство AGO, трансметилази/ацетилази и др.) и с участието на т.нар. RISC- и RITS-подобните комплекси (вторият индуцира транскрипционно заглушаване) са способни, съответно, да индуцират RNAi/разграждане и последващо заглушаване на гени на нивата на РНК- (преди/по време на транслация) и ДНК- (по време на транскрипция на хетерохроматин).

Всяка miRNA потенциално се сдвоява с множество мишени и всяка мишена се контролира от редица miRNAs (подобно на gRNAs-медиирано пре-mRNA редактиране в трипанозомни кинетопласти). In vitro анализът показа, че регулирането на miRNAs (както и редактирането на РНК) е ключов посттранскрипционен модулатор на генната експресия. Подобни miRNAs, конкуриращи се за една и съща цел, са потенциални трансрегулатори на взаимодействията РНК-РНК и РНК-протеин.

При животни, miRNAs са най-добре проучени за нематодата Caenorhabditis Elegans; са описани над 112 гена. Тук също са открити хиляди ендогенни siRNAs (няма гени; те са свързани по-специално със сперматогенеза-медиирани транскрипти и транспозони). И двете малки многоклетъчни РНК могат да бъдат генерирани от РНК полимерази, които проявяват активност (не хомология) на RdRP-II (както за повечето други РНК) и RdRP-III типове. Зрелите малки РНК са сходни по състав (включително крайни 5'-фосфати и 3'-OH), дължина (обикновено 21-22 нуклеотида) и функция и могат да се конкурират за една и съща цел. Въпреки това, разграждането на РНК, дори когато целта е напълно комплементарна, по-често се свързва със siRNAs; транслационна репресия, с частична, обикновено 5-6 нуклеотида, комплементарност с miRNAs; и прекурсорите, съответно, са екзо-/ендогенни (стотици/хиляди нуклеотиди) за siRNAs и обикновено ендогенни (десетки/стотици нуклеотиди) за miRNAs и тяхната биогенеза е различна; обаче в някои системи тези разлики са обратими.

RNAi, медиирана от siRNAs- и miRNAs, има различни естествени роли: от регулиране на генната експресия и хетерохроматин до защита на генома срещу транспозони и вируси; но siRNAs и някои miRNAs не са запазени между видовете. Растенията (Arabidopsis thaliana) имат: siRNA, съответстващи както на гени, така и на интергенни (включително спейсери, повторения) региони; огромен брой потенциални геномни места за различни видове малки РНК. Нематодите имат и т.нар. променлива автономно експресирана 21U-RNAs (dasRNAs); те имат 5 "-Y-монофосфат, съставляват 21 нуклеотида (20 от тях са променливи) и са разположени между или вътре в интроните на протеин-кодиращи гени на повече от 5700 места в две области на хромозома IV.

MiRNAs играят важна роля в генната експресия в здравето и болестта; човек има поне 450-500 такива гена. Като се свързват обикновено с 3 "-UTR региони на иРНК (други мишени), те могат селективно и количествено (по-специално, когато премахват продуктите на нискоекспресирани гени от циркулацията), да блокират работата на някои и активността на други гени. Оказа се, че наборите от профили на експресирани микро-РНК (и техните мишени) динамично се променят по време на онтогенезата, диференциацията на клетките и тъканите. Тези промени са специфични, по-специално по време на кардиогенезата, процеса на оптимизиране на размера на дължината на дендрити и броя на синапсите на нервната клетка (с участието на miRNA-134, други малки РНК), развитието на много патологии (онкогенеза, имунодефицити, генетични заболявания, паркинсонизъм, болест на Алцхаймер, офталмологични нарушения (ретинобластом и др.) свързани с инфекции от различно естество) Общият брой на открити miRNAs нараства много по-бързо от описанието на тяхната регулаторна роля и асоциация със специфични цели.

Компютърният анализ предсказва стотици целеви иРНК за отделни miRNAs и регулиране на отделни иРНК от множество miRNA. По този начин, miRNAs могат да служат за елиминиране на целеви генни транскрипти или фина настройка на тяхната експресия на транскрипционни/транслационни нива. Теоретичните съображения и експерименталните резултати подкрепят съществуването на различни роли за miRNAs.

По-пълен списък от аспекти, свързани с основната роля на малките РНК в еукариотите в процесите на растеж/развитие и при някои патологии (включително епигеномика на рака), е отразен в прегледа.

Малки РНК в онкологията

Процесите на растеж, развитие, прогресия и метастази на тумори са придружени от много епигенетични промени, които се развиват в по-редки, трайно наследени генетични промени. Редките мутации обаче могат да имат голяма тежест (за конкретен индивид, нозология), т.к. по отношение на отделни гени (например APC, K-ras, p53), т.нар. ефектът на „фуния“, свързан с почти необратимо развитие/последствия от онкологични заболявания. Тумор-специфичната по отношение на експресионния профил на различни гени (протеини, РНК, малка РНК) хетерогенността на прогениторните клетки се дължи на свързани вариации на пренаредени епигеномни структури. Епигеномът се модулира чрез метилиране, посттранслационни модификации/замествания на хистони (с неканонични), ремоделиране на нуклеозомната структура на гени/хроматин (включително геномно отпечатване, т.е. дисфункция в експресията на алели на родителски гени и X хромозоми). Всичко това и с участието на RNAi, регулирани от малки РНК, води до появата на дефектни хетерохроматични (включително хипометилирани центромерни) структури.

Образуването на генно-специфични мутации може да бъде предшествано от известното натрупване на стотици хиляди соматични клонални мутации в прости повторения или микросателити на некодиращия (рядко кодиращ) регион, поне при тумори с микросателитен мутаторен фенотип (MMP) ; съставляват значителна част от колоректалния рак, както и рака на белия дроб, стомаха, ендометриума и др. Нестабилни моно-/хетеронуклеотидни микросателитни повторения (поли-А6-10, подобни) се срещат многократно по-често в регулаторни не- кодиращи гени, които контролират експресията на гени (интрони, интергенни), отколкото в кодиращите (екзони) региони на генома на микросателитно-нестабилни, MSI+, тумори. Въпреки че естеството на появата и механизмите на локализация на MS-стабилни/нестабилни региони не са напълно ясни, образуването на MS-нестабилност корелира с честотата на мутациите на много гени, които не са мутирали по-рано в MSI+ тумори и вероятно са канализирали пътищата на тяхното развитие; освен това, скоростта на мутациите на MSI повторенията в тези тумори се увеличава с повече от два порядъка. Не всички гени са анализирани за наличие на повторения, но степента на тяхната изменчивост в кодиращи/некодиращи региони е различна, а точността на методите за определяне на честотата на мутациите е относителна. Важно е, че некодиращите региони за MSI-променяеми повторения често са двуалелни, докато кодиращите региони са моноалелни.

Глобалното намаляване на метилирането в туморите е характерно за повторения, транспонируеми елементи (МЕ; тяхната транскрипция се увеличава), промотори, CpG сайтове на туморни супресорни miRNA гени и корелира с хипертранскрипция на ретротранспозони в напреднали ракови клетки. Обикновено флуктуациите на „метилома“ са свързани с родителски/стадий/тъкан-специфични „вълни на метилиране“ и силно метилиране на центромерни сателитни региони на хетерохроматин, регулирани от малки РНК. Когато сателитите са недостатъчно метилирани, образуваната хромозомна нестабилност е придружена от увеличаване на рекомбинацията и нарушението на ТЕ метилирането може да предизвика тяхната експресия. Тези фактори благоприятстват развитието на туморния фенотип. Терапията с малка РНК може да бъде силно специфична, но трябва да се контролира, т.к мишени могат да бъдат не само отделни, но и много тРНК/РНК молекули и новосинтезирана РНК от различни (включително некодиращи интергенни повторения) региони на хромозоми.

По-голямата част от човешкия геном се състои от повторения и ТЕ. Ретротранспозон L1 (LINE елемент) съдържа, подобно на ендогенните ретровируси, реверстаза (RTase), ендонуклеаза и е потенциално способен да носи неавтономни (Alu, SVA и др.) ретроелементи; заглушаването на L1/подобни елементи възниква в резултат на метилиране в CpG места. Имайте предвид, че сред CpG сайтовете на генома, CpG островите на генни промотори са слабо метилирани, а самият 5-метилцитозин е потенциално мутагенна база, която се деаминира в тимин (химически или с участието на РНК/(ДНК) редактиране, ДНК ремонт); обаче някои от CpG островите са обект на прекомерно аберантно метилиране, придружено от потискане на супресорния ген и развитие на рак. Следваща: РНК-свързващ протеин, кодиран от L1, взаимодействащ с протеини AGO2 (от семейството Argo-naute) и FMRP (крехка умствена изостаналост, протеин на ефекторния RISC комплекс), насърчава движението на L1 елемента - което показва възможна взаимна регулиране на системите RNAi и ретропозиции на човешки LINE елементи. Важно е по-специално, че Alu повторенията могат да се движат в областта на интронно/екзонното пространство на гените.

Тези и подобни механизми могат да подобрят патологичната пластичност на генома на туморната клетка. Потискането на RTase (кодирана, подобно на ендонуклеаза, от L1 елементи; RTase също се кодира от ендогенни ретровируси) чрез RNAi механизма е придружено от намаляване на пролиферацията и увеличаване на диференциацията в редица ракови клетъчни линии. При въвеждане на L1 елемента в протоонкоген или супресорен ген, се наблюдават двойноверижни прекъсвания на ДНК. В тъканите на зародишната линия (мишки/човек) нивото на експресия на L1 се повишава и неговото метилиране зависи от системата за заглушаване, свързана с piRNAs-(26-30-bp), където PIWI протеините са варианти на голямото семейство на Argo -naute протеини, мутации в които водят до деметилиране/дерепресия на L1/подобни елементи с дълги терминални повторения. Пътищата на заглушаване на rasiRNAs са свързани с PIWI протеини в по-голяма степен, отколкото с Dicer-1/2 и Ago протеини. Медиираните от piRNAs/siRNAs заглушаващи пътища се реализират чрез вътрешноядрени тела, съдържащи големи еволюционно запазени мултипротеинови PcG комплекси, чиито функции често са нарушени в туморните клетки. Тези комплекси са отговорни за действие на дълги разстояния (чрез повече от 10 kb, между хромозомите) и регулират клъстера от HOX гени, отговорни за плана на тялото.

Нови принципи на антисенс терапията могат да бъдат разработени, като се вземат предвид познанията за по-силно специфични (от хистон-модифициращите инхибитори на ДНК/протеиновото метилиране) антитуморни епигеномни агенти, основните принципи на заглушаване на епигеномната РНК и ролята на малките РНК в канцерогенезата.

Микро-РНК в онкологията

Известно е, че увеличаването на туморния растеж и метастазите може да бъде придружено от увеличаване на някои и намаляване на експресията на други индивиди/набори от miRNAs (Таблица 1). Някои от тях може да имат каузална роля в онкогенезата; и дори същите miRNAs (като miR-21/-24) в различни туморни клетки могат да проявяват както онкогенни, така и потискащи свойства. Всеки тип човешки злокачествени тумори е ясно различим със своя "miRNA-отпечатък", а някои miRNAs могат да функционират като онкогени, туморни супресори, инициатори на клетъчна миграция, инвазия, метастази. В патологично променените тъкани често се открива намален брой ключови miRNAs, вероятно включени в системите за защита срещу рак. miRNAs (miRs), участващи в онкогенезата, са формирали концепцията за т.нар. "oncomirax": анализът на експресията на повече от 200 miRNAs от над 1000 проби от лимфоми и солидни ракови заболявания успешно класифицира туморите в подтипове според техния произход и етап на диференциация. Функциите и ролята на miRNAs са успешно проучени с помощта на: анти-miR олигонуклеотиди, модифицирани (за удължаване на живота) при 2'-O-метил и 2'-O-метоксиетил групи; както и LNA олигонуклеотиди, в които кислородните атоми на рибозата в позиции 2 "и 4" са свързани с метиленов мост.

(Маса 1)……………….

Тумор	miRNAs
Рак на белите дробове	17-92 , нека-7↓ , 124a↓ , 126 ↓ , 143 ↓ , 145 ↓ , 155 , 191 , 205 , 210
Рак на млечната жлеза	21 , 125b↓ , 145 ↓ , 155
Рак на простатата	15а ↓ , 16-1 ↓ , 21 , 143 ↓ ,145 ↓
рак на червата	19а , 21 , 143 ↓ , 145 ↓
Рак на панкреаса	21 , 103 , 107 , 155 v
рак на яйчниците	210
Хронична лимфоцитна левкемия	15а ↓ , 16-1 ↓ , 16-2 , 23 б , 24-1 , 29 ↓ , 146 , 155 , 195 , 221 , 223 ↓

маса 1 .

miRNAs, чиято експресия се увеличава () или намалява ( ↓ ) при някои от по-често срещаните тумори в сравнение с нормалните тъкани (вижте също ).

Смята се, че регулаторната роля на експресията, изчезването и амплификацията на гените на miRNA в предразположението към иницииране, растеж и прогресия на повечето тумори е значителна и мутациите в двойките miRNA/mRNA-мишени са синхронизирани. Профилът на експресия на miRNAs може да се използва за класификация, диагностика и клинична прогноза в онкологията. Промените в експресията на miRNAs могат да повлияят на клетъчния цикъл, програмата за оцеляване на клетката. Мутациите на miRNAs в стволови и соматични клетки (както и подбор на полиморфни целеви варианти на иРНК) могат да допринесат или дори да играят критична роля в растежа, прогресията и патофизиологията на много (ако не всички) злокачествени новообразувания. С помощта на miRNAs е възможна корекция на апоптоза.

В допълнение към отделните miRNAs, бяха открити техните клъстери, действащи като онкоген, който провокира развитието, по-специално, на рак на хемопоетичната тъкан при опитни мишки; гените на miRNAs с онкогенни и супресорни свойства могат да бъдат разположени в един и същи клъстер. Клъстерният анализ на профилите на експресия на miRNAs в тумори дава възможност да се определи неговият произход (епител, хематопоетична тъкан и др.) и да се класифицират различни тумори от една и съща тъкан с неидентични механизми на трансформация. Профилирането на експресията на miRNAs може да се извърши с помощта на нано-/микромасиви; точността на такава класификация, когато се разработи технологията (което не е лесно), се оказва по-висока, отколкото при използването на mRNA профили. Някои от miRNAs участват в диференциацията на хематопоетичните клетки (миши, човешки), като инициират прогресията на раковите клетки. Човешките miRNA гени често се намират в т.нар. "крехки" места, области с преобладаване на делеции/инсерции, прекъсвания на точки, транслокации, транспозиции, минимално изтриваеми и амплифицирани хетерохроматинови региони, участващи в онкогенезата.

Ангиогенеза . Ролята на miRNAs в ангиогенезата вероятно е значителна. Увеличаването на ангиогенезата при някои Myc-активирани човешки аденокарциноми е придружено от промяна в модела на експресия на някои miRNAs, докато генният нокдаун на други miRNAs води до отслабване и потискане на туморния растеж. Растежът на тумора е придружен от мутации в K-ras, Myc и TP53 гени, повишено производство на ангиогенен VEGF фактор и степента на Myc-асоциирана васкуларизация; докато антиангиогенните фактори Tsp1 и CTGF бяха потиснати от miR-17-92 и други свързани с клъстер miRNAs. Туморната ангиогенеза и васкуларизацията бяха засилени (особено в колоноцитите), когато два онкогена бяха коекспресирани в по-голяма степен от един.

Неутрализацията на антиангиогенния фактор LATS2, инхибитор на животинска циклин-зависима киназа (CDK2; човек/мишка), с miRNAs-372/373 ("потенциални онкогени") стимулира растежа на тумора на тестисите, без да уврежда гена p53.

Потенциални модулатори на ангиогенните свойства (in-vitro/in-vivo) са miR-221/222, чиито мишени, c-Kit рецептори (други), са фактори на ангиогенеза на ендотелни венозни HUVEC клетки на пъпната връв и др. Тези miRNAs и c- Комплектът взаимодейства като част от сложен цикъл, който контролира способността на ендотелните клетки да образуват нови капиляри.

Хронична лимфоцитна левкемия (ХЛЛ). При В-клетъчна хронична лимфоцитна левкемия (ХЛЛ) се забелязва намалено ниво на експресия на гените miR-15a/miR-16-1 (и други) в областта 13q14 на човешката хромозома - мястото на най-често срещаните структурни аномалии (включително делеции на 30kb региона), въпреки че геномът експресира стотици зрели и предчовешки miRNAs. И двете miRNAs, потенциално ефективни при туморна терапия, съдържат антисенс области на антиапоптотичния Bcl2 протеин, потискат неговата свръхекспресия, стимулират апоптозата, но почти/напълно липсват в две трети от бездомните CLL клетки. Чести мутации на секвенирани miRNAs в стволови/соматични клетки са идентифицирани при 11 от 75 пациенти (14,7%) със семейно предразположение към CLL (неизвестен начин на унаследяване), но не и при 160 здрави пациенти. Тези наблюдения повдигат предположението за директна функция на miRNAs в левкемогенезата. Понастоящем не се знае всичко за връзката между нивата на генна експресия на miRNAs (и техните функции) и други гени в нормални/туморни клетки.

документ

Уместност. Нарушаването на функцията на лицевия нерв по време на операция на паротидната слюнчена жлеза е един от спешните проблеми и се определя както от разпространението на заболяването, така и от значителна честота.

Dawson Church - геният във вашите гени епигенетична медицина и новата биология на намерението www e - puzzle ru библиотека книга www e - пъзел ru библиотека съдържание

Книга

Етика духовност онкология hiv p garyaev* a enfi резюме

документ

Тази статия отразява нов поглед върху проблема с онкологията и ХИВ инфекцията в светлината на лингвистично-вълновата генетика (LVG) и теорията на есенциалното кодиране (ESC) въз основа на руските и други социокултурни реалности.

Изследователски център по онкология и Анастасия Сергеевна Одинцова нови схеми на химиотерапия за напреднал и рецидивиращ рак на маточната шийка 14 01 12 – онкология

Теза

4.4. Определяне на уридинглюкоронилтрансферазния изоензимен ген (UGT1A1) в кръвния серум на пациенти с рак на маточната шийка, които са получили първа линия химиотерапия с иринотекан с платинови производни 105

Дължината на siRNA е 21-25 bp; те се образуват от dsRNA. Източникът на такива РНК могат да бъдат вирусни инфекции, генетични конструкции, въведени в генома, дълги фиби в транскриптите и двупосочна транскрипция на транспозируеми елементи.
dsRNAs се нарязват от RNase Dicer на 21-25 bp фрагменти. с 3" краища, изпъкнали от 2 нуклеотида, след което една от веригите е част от RISC и насочва разрязването на хомоложни РНК. RISC съдържа siRNA, съответстващи както на плюс-, така и на минус-вериги на dsRNA. siRNAs нямат свои собствени гени и представляват фрагменти от по-дълги РНК. siRNAs насочват изрязването на целевата РНК, тъй като са напълно комплементарни към нея. При растенията, гъбите и нематодите РНК-зависимите РНК полимерази участват в потискането на генната експресия, за което също и siRNAs служат като праймери (семена за синтеза на нова РНК Получената dsRNA се нарязва с Dicer, образуват се нови siRNAs, които са вторични, като по този начин се усилва сигнала.

РНК интерференция

През 1998 г. Крейг С. Мело и Андрю Файър публикуваха в Nature, в които се посочва, че двуверижните РНК (dsRNAs) са в състояние да потиснат генната експресия. По-късно се оказа, че активният принцип в този процес е късата едноверижна РНК. Механизмът на потискане на генната експресия от тези РНК се нарича
РНК интерференция и РНК заглушаване. Такъв механизъм е открит във всички големи таксони на еукариоти: гръбначни и безгръбначни, растения и гъби. През 2006 г. беше присъдена Нобелова награда за това откритие.
Потискането на експресията може да се случи на ниво транскрипция или след транскрипция. Оказа се, че във всички случаи е необходим подобен набор от протеини и къси (21-32 bp) РНК.
siRNAs регулират генната активност по два начина. Както беше обсъдено по-горе, те насочват разрязването на целеви РНК. Това явление се нарича "потискане" ( потискане) в гъби, " пост-транслационно генно заглушаване"в растенията и" РНК интерференция "при животни. siRNAs с дължина 21-23 bp участват в тези процеси. Друг вид ефект, siRNAs, са в състояние да потиснат транскрипцията на гени, съдържащи хомоложни siRNA последователности. Това явление се нарича заглушаване на транскрипционния ген (TGS) и се намира в дрожди, растения и животни. siRNAs също насочват ДНК метилиране, което води до образуването на хетерохроматин и транскрипционна репресия. TGS е най-добре проучен в дрождите S. pombe, където е установено, че siRNAs се вмъкват в RISC-подобен протеинов комплекс, наречен RITS. В неговия случай, както и в случая на RISC, siRNA взаимодейства с протеин от семейството AGO. Вероятно siRNA е в състояние да насочи този комплекс към ген, който съдържа хомоложен siRNA фрагмент. След това RITS протеините набират метилтрансферази, в резултат на което се образува хетерохроматин в локуса, кодиращ гена мишена siRNA, и активната генна експресия спира.

Роля в клетъчните процеси

Какво е значението на siRNA в клетката?
siRNAs участват в клетъчната защита срещу вируси, трансгенна репресия, регулиране на някои гени и образуване на центромерен хетерохроматин. Важна функция на siRNA е потискането на експресията на мобилни генетични елементи. Такова потискане може да се случи както на транскрипционно ниво, така и след транскрипционно.
Геномът на някои от вирусите се състои от ДНК, в някои от тях - от РНК, освен това РНК във вирусите може да бъде както едноверижна, така и двуверижна. Процесът на разрязване на чуждата (вирусна) иРНК в този случай протича по същия начин, както е описано по-горе, т.е. чрез активиране на RISC ензимния комплекс. Въпреки това, за да бъдат по-ефективни, растенията и насекомите са измислили уникален начин за засилване на защитния ефект на siRNA. Прикрепвайки се към веригата на иРНК, областта на siRNA може, с помощта на ензимния комплекс DICER, първо да завърши втората верига на иРНК и след това да я разреже на различни места, създавайки по този начин разнообразие от "вторични" siRNA. Те от своя страна образуват RISC и пренасят иРНК през всички етапи, обсъдени по-горе, до пълното й унищожаване. Такива "вторични" молекули ще могат специфично да се свързват не само към мястото на вирусната иРНК, към което е насочена "първичната" молекула, но също и към други места, което драстично повишава ефективността на клетъчната защита.

Така в растенията и по-нисшите животински организми siRNAs са важна връзка в един вид "вътреклетъчен имунитет", който им позволява да разпознават и бързо унищожават чуждата РНК. В случай, че вирус, съдържащ РНК, влезе в клетката, такава защитна система ще предотврати размножаването й. Ако вирусът съдържа ДНК, системата siRNA ще попречи на производството му на вирусни протеини (тъй като необходимата за това иРНК ще бъде разпозната и отрязана) и използването на тази стратегия ще забави разпространението му в тялото.

При бозайниците, за разлика от насекомите и растенията, действа и друга защитна система. Когато чужда РНК, чиято дължина е повече от 30 bp, навлезе в "зряла" (диференцирана) клетка на бозайник, клетката започва да синтезира интерферон. Интерферонът, свързващ се със специфични рецептори на клетъчната повърхност, е в състояние да стимулира цяла група гени в клетката. В резултат на това в клетката се синтезират няколко вида ензими, които инхибират синтеза на протеини и разцепват вирусната РНК. В допълнение, интерферонът може да действа върху съседни, все още неинфектирани клетки, като по този начин блокира възможното разпространение на вируса.

Както можете да видите, и двете системи са сходни в много отношения: имат обща цел и "методи" на работа. Дори самите имена "интерферон" и "(РНК) интерференция" идват от общ корен. Но те имат и една много съществена разлика: ако интерферонът при първите признаци на инвазия просто "замрази" работата на клетката, предотвратявайки (за всеки случай) производството на много, включително "невинни" протеини в клетката, тогава системата siRNA е изключително разбираема: всяка siRNA ще разпознае и унищожи само своята собствена специфична иРНК. Заместването само на един нуклеотид в siRNA води до рязко намаляване на ефекта на интерференцията . Нито един от известните досега генни блокери няма такава изключителна специфичност по отношение на своя целеви ген.

Откриването на РНК интерференцията даде нова надежда в борбата срещу СПИН и рак. Възможно е чрез използване на siRNA терапия заедно с традиционната антивирусна терапия да се постигне потенциращ ефект, когато два ефекта водят до по-изразен терапевтичен ефект от простата сума на всеки от тях, приложен поотделно.
За да се използва механизмът на сиРНК интерференция в клетките на бозайници, готови двуверижни siRNA молекули трябва да бъдат въведени в клетките. Оптималният размер на такива синтетични siRNA е същите 21-28 нуклеотида. Ако увеличите дължината му, клетките ще реагират с производството на интерферон и намаляване на протеиновия синтез. Синтетичните siRNA могат да влязат както в заразени, така и в здрави клетки и намаляването на производството на протеин в неинфектирани клетки би било крайно нежелателно. От друга страна, ако се опитате да използвате siRNA, по-малка от 21 нуклеотида, специфичността на нейното свързване с желаната иРНК и способността за образуване на RISC комплекс са рязко намалени.

Ако по един или друг начин е възможно да се достави siRNA, която има способността да се свързва с която и да е част от генома на ХИВ (която, както знаете, се състои от РНК), можете да опитате да предотвратите интегрирането й в ДНК на клетка гостоприемник. Освен това учените разработват начини за въздействие върху различните етапи на репродукцията на ХИВ в вече заразена клетка. Последният подход няма да осигури лечение, но може значително да намали скоростта на репродукция на вируса и да даде на притиснатата в ъгъла имунна система шанс да „почине“ от вирусната атака и да се опита да се справи с остатъците от самата болест. На фигурата тези два етапа на репродукция на ХИВ в клетката, които, както се надяват учените, могат да бъдат блокирани с помощта на siRNA, са маркирани с червени кръстове (етапи 4-5 - вграждане на вируса в хромозомата и етапи 5-6 - сглобяване на вируса и излизане от клетката).

Към днешна дата обаче всичко изброено по-горе се отнася само за областта на теорията. На практика, siRNA терапията среща трудности, които учените все още не са успели да заобиколят. Например, в случай на антивирусна терапия, високата специфичност на siRNA може да изиграе жестока шега: както е известно, вирусите имат способността бързо да мутират, т.е. променят състава на техните нуклеотиди. В това особено успешен е ХИВ, чиято честота на промените е такава, че при човек, заразен с един подтип на вируса, след няколко години може да се изолира напълно различен подтип. В този случай модифицираният щам на HIV автоматично ще стане нечувствителен към siRNA, избрана в началото на терапията.

Стареене и канцерогенеза

Както всеки епигенетичен фактор, siRNAs влияят върху експресията на гени, които ги правят „мълчаливи“. Сега има произведения, които описват експерименти за изключване на гени, свързани с тумори. Гените се изключват (нокдаун) с помощта на siRNA. Например, китайски учени са използвали siRNA, за да изключат гена на транскрипционния фактор 4 (TCF4), чиято активност причинява синдром на Пит-Хопкинс (много рядко генетично заболяване, характеризиращо се с умствена изостаналост и епизоди на хипервентилация и апнея) и други психични заболявания. В тази работа ние изследвахме ролята на TCF4 в раковите клетки на стомаха. Ектопичната експресия на TCF4 намалява клетъчния растеж в клетъчните линии на рак на стомаха, а нокаутът на siRNA на TCF4 гена увеличава клетъчната миграция. По този начин може да се заключи, че епигенетичното заглушаване на гена TCF4 играе важна роля в образуването и развитието на тумора.

Според изследване в отдела по онкология, Център за рак на Алберт Айнщайн, ръководен от Леонард Х. Аугенлихт, siRNA участва в изключване на гена HDAC4, което причинява инхибиране на растежа на рак на дебелото черво, апоптоза и повишена транскрипция на p21. HDAC4 е хистон деацетилаза, която е тъканно специфична, потиска клетъчната диференциация и се регулира надолу по време на процеса на клетъчна диференциация. Работата показва, че HDAC4 е важен регулатор на пролиферацията на клетките на дебелото черво (което е важно в процеса на рак) и той от своя страна се регулира от siRNA.

Катедрата по патология на Медицинския факултет на Медицинския университет в Нара в Япония проведе изследване на рак на простатата. Репликативното клетъчно стареене е бариера срещу неконтролираното делене и канцерогенезата. Краткотрайните делящи се клетки (TAC) са част от клетъчната популация на простатата, от която се развива туморът. Японски учени изследвали причините, поради които тези клетки преодоляват стареенето. Клетките на простатата в културата бяха трансфектирани с junB siRNA. В тези клетки се наблюдава повишено ниво на експресия на p53, p21, p16 и pRb, което се открива по време на стареене. Клетките в културата, които показват намалени нива на р16, се използват за следващата стъпка. Повтарящата се трансфекция на siRNA в TAC позволява на клетките да избегнат стареенето при инактивиране на p16/pRb. В допълнение, заглушаването на junB протоонкогена от junB siRNA причинява клетъчна инвазия. Въз основа на това беше направено заключението, че junB е елемент за p16 и насърчава клетъчното стареене, предотвратявайки злокачествеността (злокачествеността) на TAC. По този начин junB е регулатор на канцерогенезата на простатата и може да бъде цел за терапевтична интервенция. И неговата активност може да се регулира с помощта на siRNA.

Провеждат се много такива проучвания. В момента siRNA е не само обект, но и инструмент в ръцете на медицински изследовател, биолог, онколог и геронтолог. Изучаването на връзката на siRNA с онкологични заболявания, с експресията на свързани с възрастта гени, е най-важната задача за науката. Измина доста време от откриването на siRNA и колко интересни проучвания и публикации, свързани с тях, се появиха. Няма съмнение, че тяхното изследване ще се превърне в една от стъпките на човечеството към победата над рака и стареенето...